研究背景及目的胃轻瘫是指胃在无机械性梗阻时出现的一组延迟性胃排空症状的临床表现，主要包括早饱、恶心、呕吐、胃肠胀气及腹部不适等。其中，糖尿病是胃轻瘫最主要的致病因素，且由于糖尿病发病人数的急剧增多，由糖尿病引起的胃轻瘫也越来越受到重视。胃轻瘫虽然不会直接增加死亡率，但是其可以引起营养不良、电解质失衡、血糖控制差、频繁住院等，严重影响了患者的生活质量。正常的胃排空需要肠神经、肠外自主神经、卡哈尔间质细胞（ICC，interstitial cellsof Cajal）以及平滑肌细胞之间的相互作用，许多研究者在糖尿病胃轻瘫的动物模型及患者上观察到了肠神经、迷走神经、ICC以及平滑肌细胞的病理改变。在这些病变中，肠神经中含神经源性一氧化氮合酶（neuronal nitric oxide synthase，nNOS）神经元表达的减少最引人注目，但是其确切的病变机制尚不清楚。谷氨酸是中枢神经系统中一种经典的兴奋性神经递质，既介导了兴奋性神经传递的生理作用，又在病理条件下介导了神经兴奋毒性作用，后者主要是通过过度激活表达在nNOS神经元上的NR2B受体继而导致钙离子过度内流，一氧化氮（nitricoxide，NO）产生过多最终诱发神经元凋亡。但如果给予NR2B受体拮抗剂，虽然可以保护神经元避免神经兴奋毒性反应，却阻断了正常的神经元细胞活动，产生了较大的副作用，增加了脑卒中患者的死亡率。因而，越来越多的研究者在寻找更特异的神经元兴奋毒性的阻断靶点。既往有报道谷氨酸及其受体亦可分布在肠神经系统，但未有报道其在糖尿病胃轻瘫及选择性nNOS神经元凋亡中的作用。在本课题中，我们将证明：1、谷氨酸系统存在于胃肌间神经丛中；2、谷氨酸兴奋毒性可以导致糖尿病胃轻瘫及选择性nNOS神经元减少；3、特异性阻断NMDAR-PSD-95-nNOS蛋白相互作用可以保护nNOS神经元及改善糖尿病胃轻瘫。实验方法1、利用Sprague-Dawley大鼠建立糖尿病胃轻瘫动物模型。1）链脲霉素（streptozotocin，STZ）（55mg/kg）腹腔注射，48h后尾静脉采血监测血糖及体重变化。2）6周后测量4小时胃固体排空率评估大鼠是否出现胃排空延迟。3）利用免疫荧光、Western blot技术确定nNOS、乙酰胆碱转移酶（Cholineacetyltransferase，ChAT）表达的变化。2、通过抑制谷氨酸重摄取来模拟谷氨酸兴奋毒性。谷氨酸被释放进入突触间隙后，依赖于再摄取作用来终止其神经递质作用，分布于胶质细胞的兴奋性氨基酸转运体2（excitatory amino acid transporter2，EAAT2）承担了90%以上的转运任务。小干扰RNA（small interfering RNA， siRNA）是一种小RNA分子，可与之互补的mRNA结合从而沉默后者的表达。1）利用免疫荧光技术确认谷氨酸系统的全部组成成分如vGLUT1、NR2B、PSD-95、GS、EAAT2等是否存在于胃肌间神经丛中。2）将针对EAAT2siRNA注射进入浆肌层，利用电穿孔技术将siRNA转入细胞内。3）利用qPCR以及Western blot技术确认siRNA是否有抑制目的基因EAAT2mRNA及蛋白的表达。4）5天后测量4小时胃固体排空率评估注射siRNA大鼠是否出现胃排空延迟。5）利用免疫荧光、Western blot技术确定nNOS、ChAT的表达变化。3、合成特异性干扰NMDAR-PSD-95-nNOS蛋白相互作用的肽段Tat-NR2B9c（Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg--Lys-Leu-Ser-Ser-Ile-Glu-Ser-Asp-Val），并通过离体与在体的方法验证其对nNOS神经元及胃轻瘫的作用。1）给予自带荧光基团5-FAM的100uM的Tat-NR2B9c，在胃全层（去除胃黏膜层及黏膜下层，保留固有肌层及其中的肠神经，whole mount）离体培养1小时后，利用免疫荧光评估其能否进入神经元细胞。2）在胃全层离体培养中，利用酶联免疫法测定cGMP的含量，评估预先1小时给予50nM Tat-NR2B9c能否抑制由100uM NMDA诱导产生的cGMP。3）在胃全层离体培养中，利用免疫荧光，评估预先1小时给予50nM Tat-NR2B9c能否抑制nNOS神经元的凋亡。4）siRNA注射及电穿孔后，在D0、2、4天给予大鼠Tat-NR2B9c（2.6mg/kg）腹腔注射，在D5天评估其EAAT2、nNOS、ChAT的表达以及胃固体排空率。5）STZ诱导大鼠糖尿病模型成功后，从第四周持续每天给予Tat-NR2B9c（2.6mg/kg）腹腔注射至第六周，在第六周评估其nNOS、ChAT的表达以及胃固体排空率。实验结果1、STZ可以成功诱导糖尿病胃轻瘫大鼠模型1）STZ（55mg/kg）腹腔注射后可以使STZ大鼠血糖上升（波动于300~450mg/dl之间），对照组则稳定在70~110mg/dl之间。2）STZ诱导糖尿病大鼠出现胃固体排空率下降，46.8+3.3%VS对照组71.7+4.4%。3）STZ诱导糖尿病大鼠nNOS表达量下降，为对照组的54.1±3.55%；但ChAT的表达量与对照组相比无明显差异。2、注射针对EAAT2的siRNA可以使大鼠出现胃排空延迟及nNOS表达下降。1）免疫荧光显示vGLUT1、NR2B、PSD-95、GS、EAAT2存在于胃肌间神经丛中。2）给予胃浆肌层注射针对EAAT2的siRNA组大鼠，EAAT2mRNA的表达量下降至对照组的54.03±3.54%；EAAT2蛋白的表达量下降至对照组的67.47±2.92%。3）siRNA组大鼠nNOS表达量下降，为对照组的40.9±2.73%；但ChAT的表达量与对照组相比无明显差异。4）siRNA组大鼠出现胃固体排空率下降，43.4±4.04%VS对照组72.6±2.93%。3、Tat-NR2B9c在离体及在体实验中可保护nNOS神经元及改善胃排空率。1）在胃全层体外培养中，免疫荧光显示Tat-NR2B9c可以进入神经元。2）NMDA可以引起胃全层cGMP的升高，50nM Tat-NR2B9c可以使100uMNMDA产生的cGMP下降26.8±3.12%。3）在胃全层体外培养中，100uM NMDA刺激可以使nNOS神经元的Caspase-3表达上升（59.17±3.43%VS对照组0）；给予50nM Tat-NR2B9c可以减少nNOS神经元的Caspase-3的表达（24.58±3.14%VS59.17±3.43%）。4）在胃whole mount体外培养中，100uM NMDA刺激可以使每个神经节nNOS神经元数目下降（4.0±0.40个/神经节VS对照组7.0±0.40个/神经节）；给予50nMTat-NR2B9c可以减少每个神经节nNOS神经元数目的下降（6.25±0.63个/神经节VS4.0±0.40个/神经节）。5）给予胃浆肌层注射针对EAAT2siRNA的大鼠，给予Tat-NR2B9c，nNOS的表达上升（78.4±4.36%VS40.9±2.73%），nNOS阳性神经元的数目也上升（14.8±1.15%VS24.4±2.25%）；同时，大鼠胃固体排空率也上升（65.9±5.38%VS43.4±4.04%）。6）STZ诱发糖尿病大鼠，给予Tat-NR2B9c，nNOS的表达上升（77.8±3.38%VS54.1±3.55%），nNOS阳性神经元的数目也上升（26.3±0.95%VS16.8±0.85%）；同时，大鼠胃固体排空率也上升（64.6±2.61%VS46.8+3.3%）。实验结论1、STZ腹腔注射可以模拟出糖尿病胃轻瘫大鼠模型，并出现选择性nNOS表达下降。2、谷氨酸系统存在于胃肌间神经丛中，针对EAAT2的siRNA于胃浆肌层中注射，可以诱发谷氨酸兴奋毒性，引起模型组大鼠选择性nNOS表达下降，并出现胃轻瘫。3、Tat-NR2B9c不仅可以进入神经元细胞，还可以通过抑制nNOS的活性来降低cGMP的产量。4、Tat-NR2B9c既可以在离体中保护nNOS神经元避免谷氨酸兴奋毒性，又可以在体在siRNA模型组及STZ诱导糖尿病组大鼠中保护nNOS神经元的凋亡和改善胃固体排空率。