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目的:茅莓是蔷薇科悬钩子属的植物茅莓Rubus parvifolius L.的干燥根,具有清热凉血,祛风止痛的作用,主要用于感冒发热,咽喉炎症,慢性肾盂肾炎、风湿性疾病等常见病。茅莓根在“鼻咽灵”等中成药中作为主要原料,在抗鼻咽癌方面具有一定的作用。由于蔷薇科悬钩子属植物的形态以及在名称上常有混淆,并且同名异物现象比较严重。茅莓别名为蛇泡簕,而悬钩子属植物习惯以藨、悬钩子命名,《岭南采药录》所载蛇泡筋的别名为虎掌、山象皮,在广东、广西等地民间有大叶蛇泡筋被当做蛇泡簕使用的情况,造成了与同属的大叶蛇泡簕混淆。茅莓在心血管系统、抗肿瘤方面药理作用显著,但其药效物质尚未明确,其化学成分以及基于分子生物学的鉴定研究较少。为保证茅莓根药材来源的准确性,保证临床安全用药以及了解其物质基础,本实验利用DNA条形码技术对茅莓根进行鉴定研究,利用色谱技术对茅莓根进行比较系统的化学成分的研究。 方法:分子鉴定部分,实验收集来源于不同产地的茅莓基原物种和药材,经初步的形态鉴定后,提取总的DNA,并进行双向测序。使用CondonCode Aligner V5.1.3DNA序列分析软件对测序峰图进行质量评价与拼接,去除低质量序列和引物区。实验采用ITS2序列进行分析研究,将经过拼接后得到的序列,去除序列两端的5.8S和28S区段,使用基于隐马尔可夫模型HMMer注释方法来获得ITS2间隔区序列。采用MEGA6.0(molecular evolutionary genetics analysis)序列分析软件对ITS2序列进行序列分析,采用遗传距离法中的Kimura-2-parameterdistance(K2P)模型计算茅莓的种内、种间的遗传距离,运用比对法(Blast)对ITS2序列鉴定能力进行检测。化学成分研究部分,茅莓根粗粉用10倍量的90%乙醇进行提取,减压浓缩后,得到乙醇干浸膏1.42 Kg,经有机溶剂石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇依次进行萃取。将得到的石油醚萃取部位54.8 g以及乙酸乙酯萃取部位120.0 g经硅胶柱层析色谱,葡聚糖凝胶柱色谱以及有机溶剂重结晶等分离纯化手段进行研究。通过理化常数进行初步鉴定后,同时结合现代波谱等仪器分析方法来鉴定分离得到的单体化合物。 结果:茅莓ITS2序列经MEGA6.0软件比对后长度为212 bp,茅莓的种内最大K2P遗传距离为0.014。分析序列时发现茅莓ITS2序列上在3个变异位点,平均GC含量为57.42%。基于ITS2序列构建Neighbor Joining(NJ)树,茅莓与其近缘种及混伪品能够表现出良好的单系性,并且可以相互区分。利用所得结果对药材市场中的茅莓根进行鉴定,从药材市场购买的23份茅莓根样品,DNA提取和扩增成功率为100%,采用NJ树建树分析,其中13份药材样品与茅莓聚为一支,其余10份属于其他物种。对茅莓根药材进行化学成分研究,分离并鉴定得到18个化合物,通过化合物的理化特性,同时结合现代波谱技术进行分析鉴定,同时核对文献材料,经解析鉴定后,分别为羽扇豆烷-3-酮(Lupan-3-one)(1)、大黄酚(Chrysophanol)(2)、大黄素甲醚(Physcion)(3)、正十九烷醇(1-Nonadecanol)(4)、β-谷甾醇(β-sitostrol)(5)、3-β-乙酰氧基-12-烯-28-乌苏酸(Ursolic acidacetate)(6)、豆甾烷-3,6-二酮(Stigmastane-3,6-dione)(7)、3β-乙酰氧基-11α,12a-环氧-齐墩果烷-28,13β-内酯(3-O-Acetyl-11α,12α-epoxy-oleanan-28,13β-olide)(8)、3-O-乙酰坡模酸(3-O-Acetyl-pomolic acid)(9)、熊果酸(Ursolic acid)(10)、齐墩果酸(Oleanolic acid)(11)、橙黄胡椒酰胺(Aurantiamide acetate)(12)、十九烷酸单甘油酯(Monononadecanoin)(13)、蔷薇酸(Euscaphic acid)(14)、19α-羟基乌苏酸(Urs-12-en-28-oic acid)(15)、委陵菜酸(Tormentic acid)(16)、表儿茶素(-)-epi-catechin(17)、胡萝卜苷(Daucosterol)(18)。 结论:利用DNA条形码中ITS2序列对茅莓根及其近缘种与混伪品进行了准确的鉴定,为茅莓根药材的有效鉴定提供了分子生物学鉴定依据,表明ITS2条形码技术在市场药材鉴定中具有良好的鉴定能力,同时为悬钩子属类药用植物的亲缘关系的分析提供一种可行的方法和依据,对于保障茅莓根及同属的中药用药安全具有重要的医药学意义。迄今为止,国内外对茅莓的化学成分及生物活性的报道较少,本实验对茅莓根进行系统的化学成分研究,分离并鉴定得到的18个化合物,其中化合物12为从蔷薇科植物首次分离得到,化合物1、2、3、4、7、8、13、17首次从该植物中分离得到。