绿色气球菌(Aerococcus viridans)为革兰氏阳性球菌,是一种重要的人畜共患病原菌,在环境中普遍存在,可以引起人和动物的多种感染甚至死亡。在兽医临床上,绿色气球菌可引起猪的脑膜炎、肺炎、尿路感染和关节炎等,此外,该菌还可引起牛临床和亚临床乳腺炎。但由于该菌与肠球菌和链球菌的形态及生化特征很相似,所以前期绿色气球菌多被误判为这两种细菌。近年来,由于鉴定方法的完善,越来越多的绿色气球菌被分离鉴定,且由于抗生素的长期不规范使用导致耐药菌株的不断出现,使该菌引起感染的治疗难度不断加大。噬菌体能够特异性的感染并杀死细菌,因此可作为细菌(特别是耐药性细菌)感染治疗的候选药物。噬菌体疗法是一种十分有前景的可以辅助甚至替代抗生素的候选疗法。目前,绿色气球菌感染的控制仍是以抗生素为主,尚未见其噬菌体及其用于感染治疗的相关报道。本研究首先从临床发病的猪场及奶牛场等分离并鉴定了14株绿色气球菌。以绿色气球菌AV-X1作为宿主菌,从污水中分离到首个感染绿色气球菌的噬菌体,并按照标准命名法将其命名为vB_AviM_AVP(简称AVP)。对其基本生物学特性做进一步研究:噬菌体AVP可在BHI固体双层平板上形成小而透亮的噬菌斑;透射电镜下呈等距、二十面体的头部和可收缩的尾部,表明该噬菌体属于肌尾噬菌体家族的一员;一步生长曲线显示噬菌体AVP的隐蔽期为10 min,潜伏期为15 min,爆发量大小约为139 PFU/cell;温度和pH值稳定性实验也表明该噬菌体具有较好的温度和pH耐受性;通过空斑法测得的裂解谱显示噬菌体AVP可以裂解现有14株气球菌中的8株。对噬菌体的全基因组进行测定和分析,表明噬菌体AVP的遗传物质为双链DNA,基因组全长为133 806 bp,G+C含量为34.51%。共165个假定开放阅读框,其中无任何已知的溶原、毒力或抗生素抗性相关基因,这为噬菌体AVP作为抗菌制剂提供了可能。通过与数据库中已知序列的比对和分析,确定ORF96为编码噬菌体AVP的裂解酶基因,并对裂解酶AVPL进行原核表达与纯化。体外活性测定表明AVPL在巴氏消毒的牛奶中有较好的杀菌活性。进一步对其3D结构和关键作用位点进行预测,以裂解酶LysGH15的Amidase结构域为模板预测得到了置信度为100%的裂解酶AVPL催化域的3D结构。根据预测的结构,对其可能的关键作用位点99E、159H和160V逐一进行定点突变为丙氨酸,后两个位点突变后AVPL的活性完全丧失,而99E位点突变后对其活性未造成影响,这说明159H和160V位点是裂解酶AVPL催化活性的关键作用位点。本文成功建立绿色气球菌感染引起的小鼠乳腺炎模型,对裂解酶AVPL和噬菌体AVP的体内治疗效果进行评价。结果表明,在乳腺内攻菌4小时后,每个乳腺给予单剂量5×10~6 PFU的噬菌体,即可起到有效的治疗效果,乳腺中的菌落数量减少,乳腺组织病理变化减轻,炎性细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平以及髓过氧化物酶(MPO)活性也明显低于PBS处理组。同时,每个乳腺单次给予5×10~7 PFU的噬菌体24小时后,乳腺组织无明显病理变化或炎症反应,表明噬菌体AVP在体内应用时具有良好的安全性。而裂解酶治疗仅降低了乳腺中的菌载量,炎症反应并未得到减轻。综上所述,本研究分离并系统鉴定了国内外首株感染绿色气球菌的噬菌体,对其裂解酶进行了重组表达,并将其用于小鼠乳腺炎模型的实验性治疗,为利用噬菌体预防和控制耐药性绿色气球菌感染提供新的途径。