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禽白血病是危害我国养禽业发展的重要传染病之一,是由禽白血病病毒和禽肉瘤病毒引起的以造血细胞增生为主的肿瘤性疾病。根据病毒的宿主范围及交叉中和试验等,将ALV分为A～J10个亚群。目前,J亚群ALV(ALV-J)流行最为广泛,已由最初的白羽肉鸡蔓延到蛋鸡和地方品系鸡(如三黄鸡、麻鸡、芦花鸡、柴鸡等)。从20世纪80年代至今,禽白血病给我国养禽业带来了巨大损失。有研究报道,应用ELISA方法对鸡群进行ALV抗原和抗体的检测,发现有的鸡群高达68.4%的阳性率,较低的也有10.4%的阳性率,同时发现有的鸡只能检出抗原或抗体,有的则二者都能检测到。本研究从血清学和病原学两个方面对苏皖部分地区ALV进行了检测、净化；同时,通过对病原的PCR扩增及序列比对鉴定了1株A亚群禽白血病病毒(ALV-A),并对ALV-A的env基因进行克隆和表达。1.苏皖部分地区ALV的流行病学调查为了解苏皖地区ALV流行情况,本研究以本实验室自制的p27抗体检测试剂盒及IDEXX公司生产的p27抗原检测试剂盒对苏皖地区5个品系的鸡群进行禽白血病的检测,检测时间为父母代300日龄左右、子代6周龄及子代22周龄。研究结果发现,受调查的5个鸡群均有鸡只呈现p27抗体阳性和抗原阳性,其中抗体个体阳性率为25.44%(6398/25153),抗原个体阳性率为24.93%(5209/20894),抗原抗体同时阳性的鸡只很少。其中,江苏地区鸡群的p27抗体阳性率为49.77%(4221/8481),安徽地区为13.06%(2177/16672),同时发现,公鸡整体抗体阳性率高于母鸡。以上结果表明,所试鸡场ALV感染普遍。2.A亚群禽白血病病毒的PCR鉴定及gp85基因序列的分析本研究在对临床组织剖检表现为肝脾明显肿大的基础上,经PCR鉴定,从送检样品中鉴定出1株A亚群禽白血病病毒(ALV-A),命名为ALV-A JSYC130902。利用分子生物技术对JSYC130902病毒env基因进行克隆测序,结果PCR扩增的env片段大小为1644bp。其中gp85序列含1020个核苷酸,与GeneBank上已发表的7个毒株氨基酸同源性为86.1-95.6%,核苷酸同源性为87.1-96.6%,与SDAU09C3株同源性最高,与RAV-1原型株相比,JSYC130902株共发生42处氨基酸突变。与RAV-1原型株及其他毒株对比发现,共发生5处独特氨基酸替换突变：即第147位由E突变为K,第157位由S突变为P,第217位由G突变为D,第325位由D突变为N,第328位由K突变为N。同时,JSYC130902株与SDAU09C3株和MAV-1株亲缘关系最近,三者与其它毒株相比在200-203位均发生插入突变GQGQ。3.ALV-AH10env基因的克隆表达本研究根据GenBank发表的SDAU09C3基因序列设计了一对针对ALV-A的引物,然后以感染了AH10的DF-1细胞基因组为模板,通过RT-PCR和PCR扩增得到1644bp的env目的片段。将env基因克隆至pFastBac1质粒中,构建了重组转移载体pFastBac1-env;通过转化DH1OBac感受态细胞,成功构建了重组穿梭质粒rBacmid-env,然后通过脂质体转染Sf9获得了重组杆状病毒。间接免疫荧光实验(IFA)结果表明,重组杆状病毒具有良好反应性。同时,我们将env目的片段克隆至原核表达载体pET-32a(+),结果成功构建了重组表达质粒pET-32a-env,并在E.coli (DE3)中获得表达,对其诱导表达条件(温度、IPTG诱导浓度)进行了摸索,最终确定在温度为28℃,IPTG终浓度为0.50mmol/L的条件下诱导5h可获得高效表达的重组蛋白,SDS-PAGE及Western blot结果均表明目的蛋白具有抗原性,大小为73KD左右。