论文部分内容阅读
Wnt信号涉及参与整个发育过程,在各种癌症中它会被不适当地激活。Wnt信号各种生命过程中也发挥重要作用,如调节胚胎早期发育、细胞分化、细胞增殖和生长等。在经典Wnt途径中,分泌的Wnt蛋白导致了β-catenin (β-链蛋白)的稳定,确定新的上游调制器对于阐明调节β-catenin活力的机制很重要。开发新的小分子抑制剂来调控Wnt信号途径及其核心部件,可能为治疗Wnt相关的癌症提供一种新的手段。本研究重点探讨了小分子化合物作用于经典Wnt途径的机制。1.化合物migrazole调节经典Wnt途径信号转导的分子机制的研究(实验一)Migrazole诱导的表型与Wnt信号途径中断的效果一致,上调migrazole的组件也可能影响Wnt途径,抑制migrazole引起的表型。通过这种方式,可以阐明migrazole在Wnt途径中的靶点。因此,要使(?)migrazole成为小分子工具,进一步研究并确认靶点是关键。本实验的目的是研究化合物：migrazole是否能抑制经典Wnt信号途径,并寻找其作用靶点。研究方法：通过蛋白印迹Western blot, TOPFLASH (TCF相关荧光素酶报告基因)信号分析1nigrazole是否能抑制Wnt途径,促进β-catenin降解。实验所用的细胞系包括了乳腺癌细胞MDA-MB231、结肠癌细胞RKO Stable,脑瘤细胞N1E115和N2A、结肠癌细胞DLD1和SW480.试验结果：将LiCl(一种GSK3β／糖原合酶激酶-3β的抑制剂)应用于TOPFLASH信号分析,证实migrazole在GSK3p的下游起到稳定作用。由于DLD1, SW480是APC(结肠腺癌样息肉基因产物)突变的肠癌细胞系,我们推论migrazole是在GSK3β的下游和APC勺上游起作用。同时通过在HEK293T和N2A细胞系中的Western blot和信号通路试验,发现migrazole也可以影响BMP信号途径,但不影响NF-KB和TGFβ信号途径。2.化合物21H7/M110抑制经典Wnt途径信号转导的分子机制(实验二)结肠癌细胞系是APC突变的细胞系,21H7/M110可以在结肠癌细胞中抑制Wnt信号通路,通过PIM (人类PIM丝氨酸／苏氨酸激酶家族)抑制经典Wnt信号途径。乳腺癌细胞MDA-MB231是APC正常的细胞系。本试验的目的是研究化合物21H7/M110是否能抑制乳腺癌细胞中Wnt信号途径以及寻找其作用靶点。试验方法：通过蛋白印迹Western blot,信号分析以及qpCR和RT-PCR的方法,分析21H7/M110是否能抑制Wnt途径促进β-catenin降解。结果发现,21H7/M110可以在乳腺癌细胞中抑制Wnt信号通路,削减PIM对乳腺癌细胞中的Wnt信号转导不起作用。21H7/M110除了诱导PIM在MDA-MB231和RKO细胞中的表达外,还能引起HIF1α(缺氧诱导因子1α)的表达以及HIF1α目标基因的表达,并且能激活缺氧诱导的血管内皮生长因子VEGF-luc reporter.研究还发现,21H7/M110是通过铁螯合剂的方式作用于经典Wnt信号途径,,表明铁螯合作用可以作为抑制Wnt信号的有效机制。3. Tankyrases通过稳定Axinl/2抑制乳腺癌细胞Wnt信号通路(实验三)化合物XAV939是Wnt信号通路的抑制剂,可以引起Axin(轴蛋白抑制剂)蛋白质水平的增加,在结肠癌细胞中通过稳定Axin破坏复合物促进β-catenin的磷酸化。本试验的目的是研究tankyrases (端锚聚合酶)是否通过稳定AXIN1/2有效地抑制乳腺癌细胞中的Wnt信号。试验方法：通过(?)Western blot蛋白印迹,Topflash和Fopflash信号分析以及实时PCR技术,在XAV939在结肠癌细胞和乳腺癌细胞中稳定AXIN1/2,刺激P-catenin降解。21H7和M110作为阳性对照,用Sulforhodamine B (SRB)(基罗丹明乙生长抑制)检测XAV939是否抑制这些细胞的生长。结果发现,XAV939在乳腺癌细胞中通过稳定AXIN1/2,抑制Wnt信号；XAV939在MDA-MB231细胞中能抑制细胞迁移和增殖。SRB生长抑制试验结果发现,与21H7和M110相比,XAV939以各种不同方式作用于经典Wnt信号途径。这些研究结果为Axin蛋白质动态平衡新的调节机制提供了新的见解,并为小分子靶向作用于Wnt信号以抑制乳腺癌提供新的治疗途径。总之,本文利用三种不同机制的小分子化合物,探索性研究了通过这些新型小分子抑制剂调控Wnt信号途径及其核心部件,为Wnt相关的癌症治疗提供一种新的手段。