背景:中耳炎（OM）是最常见的儿科疾病之一,肺炎链球菌（S.pn）是引起细菌性中耳炎的主要致病菌,其高发病率和复发率对儿童听力健康造成严重困扰。中性粒细胞是机体抵抗病原微生物感染的第一道防线,除了脱颗粒和吞噬作用外,中性细胞胞外捕获网（NETs）是2004年发现的一种中性粒细胞新的抗微生物策略,即NETosis。我们在由S.pn诱导的急性中耳炎（AOM）中发现有NETs形成,但NETs形成的机制尚不完全清楚。方法:1、听泡穿刺接种S.pn建立急性中耳炎模型,建模后24小时断颈处死小鼠取中耳,提取中耳灌洗液细胞总mRNA,测定TLR4表达量;制作中耳印片行免疫荧光染色观察NETs形成;接种S.pn同时用3-MA、DPI或DNase I处理小鼠,建模后24小时收集中耳灌洗液,计数灌洗液细胞,定量检测胞外游离DNA,并铺板计数细菌载量。2、分离WT小鼠骨髓中性粒细胞,PMA处理2.5小时诱导NETs产生,加入FITC标记的S.pn,荧光显微镜观察NETs捕获情况;诱导NETs产生后,加入cytD或DNase I抑制细胞吞噬作用或者降解DNA网状结构,然后加入S.pn处理后铺板计数S.pn载量。3、分离WT和TLR2^-/-和TLR4^-/-小鼠骨髓中性粒细胞,与S.pn共同培养0³小时,定量检测胞外游离DNA,制作细胞爬片,免疫荧光染色观察NETs结构;S.pn刺激0.5小时和2小时后分别收集细胞,提取蛋白,免疫印迹法检测LC3-II表达;用3-MA或DPI预处理WT中性粒细胞,S.pn刺激后0.5小时和2小时收集细胞总蛋白,检测LC3-II表达;S.pn刺激后0.5小时和2小时定量测定ROS。结果:1、S.pn在体内体外都能诱导中性粒细胞产生NETs,体外用S.pn刺激中性粒细胞时,2小时NETs产生达到峰值。2、在体外实验中,荧光染色结果显示NETs可以捕获S.pn,铺板计数结果显示DNase I降解NETs后细菌计数显著升高,提示NETs对S.pn有杀菌作用。3、S.pn刺激中性粒细胞2小时后,ROS产生显著增加,自噬激活显著增强,用DPI或3-MA预处理抑制ROS和自噬后,NETs形成被明显抑制;TLR4^-/-的中性粒细胞表现出ROS产生和自噬激活受损,提示TLR4可通过ROS和自噬来调控NETs的形成。结论:在S.pn性AOM中,TLR4通过上调ROS和自噬促进NETs形成以抵抗S.pn。