研究背景：帕金森病(Parkinson’s disease, PD)是一种老年人常见的中枢神经系统的渐进性神经退行性疾病,主要病理特点为中脑的黑质致密部(substantia nigra pars compacta, SNc)多巴胺能神经元退化,临床上表现为肢体静止性震颤、僵直、运动迟缓等运动功能紊乱。步态不稳也是PD患者晚期常见的运动症状之一,患者走路速度越来越慢,上肢摆动减少,启步困难,步幅减小(小碎步),呈慌张步态,常常引起患者行走时跌倒,严重影响着患者的生活质量。脑深部电刺激术(deep brain stimulation, DBS)是通过立体定向手术将刺激电极植入患者特定的深部脑神经核团,对核团进行刺激,调节引起症状的异常电活动,从而改善患者的症状,达到治疗效果。DBS是目前治疗晚期PD患者最佳的外科方法,尤其是药物难治性PD治疗中取得了显著的临床效果。目前常用于PD的DBS治疗的靶点主要有三个：丘脑腹外侧中间核(ventral intermediate nucleus, Vim)、苍白球内侧部(globus pallidus internus, GPi)及丘脑底核(subthalamic nucl eus, STN)。靶点的选择,主要取决于PD患者将要治疗的主要症状,根据患者的主要临床症状,进行灵活地选择靶点。一般来讲,Vim的DBS治疗能很有效改善PD患者的震颤和肌僵直,但对运动迟缓效果欠佳；Gpi是毁损手术治疗PD最常用的靶点,对肌僵直、运动迟缓改善效果较好,但对震颤治疗效果不佳,同时Gpi的DBS治疗也能有效改善PD患者对侧肢体的震颤、强直、运动迟缓,但对步态姿势等中轴症状改善较少；STN对运动环路的间接通道上的Gpi和SNr都有调节,是目前PD患者DBS治疗最常用的首选靶点,对肌强直、运动迟缓、震颤均有效,并可以明显减少PD患者的左旋多巴用量,但对姿势不稳、步态障碍等轴性症状改善较小近年来的临床研究提示脚桥核(pedunculopontine nucleus, PPN)电刺激可以有效改善晚期PD患者的运动症状,尤其对步态不稳、姿势障碍等轴性症状有明显疗效。有研究表明,PD状态下,PPN的神经元发生变性、凋亡,残余神经元放电不规则,代偿性地异常过度放电；低频电刺激PPN能显著改善PD患者的姿势不稳和步态障碍,提示PPN参与运动功能的调节。PPN已经成为DBS治疗PD患者的步态紊乱和姿势不稳的新靶点。应用神经毒素6-羟多巴胺(6-hydroxy dopamine,6-OHDA)制成PD模型大鼠来研究PD的病理生理,以及各种治疗方法的疗效评估的技术已经成熟并应用广泛。既往有很多的行为学方法来验证PD模型大鼠和评估治疗效果,比如,跑台测试、圆柱体试验(前肢不对称试验)、转棒试验、平衡木行走试验、阶梯行走试验、脚印分析等。但是这些方法有的只局限于前肢功能测试,有的限制于强迫性运动,有的只能测试单一的动态参数或者静态参数,并且人工记录的主观性影响和重复测试引起的误差较大。与其它行为学测试方法相比较,Catwalk自动步态分析系统可以同时检测大鼠的四只脚爪的动态的和静态的参数以及四只脚爪间的协调性,同时检测的是大鼠的自发运动行为,计算机系统的数据采集和离线分析也避免了人工记录的主观性影响。因此,越来越多的学者关注并运用Catwalk自动步态分析系统来评价各种实验动物模型的行为学特征和评估治疗效果。大鼠的脚桥被盖核(pedunculopontine tegmental nucleus, PPTg)相当于人类的PPN。那么,6-OHDA制成的PD模型大鼠的步态会有什么样变化?PPTg-DBS对PD模型大鼠的步态是否也有改善作用呢?本实验拟用Catwalk自动步态分析系统来评估PPTg-DBS对PD模型大鼠的步态作用效果,为进一步研究PPN-DBS改善PD步态的作用机制提供基础实验依据。目的：应用客观的Catwalk自动步态分析系统,观察6-OHDA制成的偏侧PD模型大鼠的步态参数变化；并且运用Catwalk系统检测经脚桥被盖核(PPTg)电刺激治疗后的偏侧PD模型大鼠的步态参数变化情况,为进一步研究PPN-DBS改善PD步态障碍的作用机理建立动物模型,提供基础实验依据。方法：1、实验分组：成年健康雄性SPF级的Sprague Dawley (SD)大鼠27只,体重控制在280g-320g之间,随机分为3组：假手术组(n=6),使用立体定向术在大鼠右侧前脑内侧纵束(medial forebrain bundle, MFB)注射生理盐水；6-OHDA组(n=6),同侧注射等量的6-OHDA制成偏侧PD模型大鼠；6-OHDA+电极组(n=15),同侧注射等量6-OHDA同时将刺激电极植入同侧PPTg。2、大鼠的Catwalk适应性训练：所有大鼠在立体定向手术前进行Catwalk适应性训练1周。将大鼠置入Catwalk通道,训练其自发连续不停顿地通过通道,每只大鼠早晚各训练一次,每次来回跑过通道3次～5次,整个实验训练在暗室中完成。训练合格标准为：大鼠需连续不停顿地通过通道,次数至少三次。训练合格后,采集Catwalk数据作为基线值。3、模型的制作和刺激电极的植入：将假手术组的大鼠麻醉后固定在立体定向仪上,根据Paxinos and Watson的《大鼠脑立体定向图谱》确定右侧前脑内侧纵束(MFB)坐标：齿杆低于耳杆3.4mm,前囟后1.8mm,旁开2.0mm,硬膜下8.3mm,按坐标将微量注射器缓慢进针到预定深度,缓慢注射4u1含0.02%抗坏血酸的生理盐水。6-OHDA组则注射10ug/4ul的6-OHDA溶液(用含有0.02%抗坏血酸的生理盐水溶解),其它步骤均一样。6-OHDA+电极组的大鼠除了以上注射6-OHDA外,还同时在显微镜下植入刺激电极,根据图谱确定PPTg的坐标：前囟后7.9mm,旁开2.1mm,硬膜下7.0mmm。植入后用牙科水泥固定。电极植入后用牙科水泥固定。电极的颅骨外侧端焊接着插座,可以与刺激电线的插口连接。大鼠术后1周恢复期给予自由饮食饮水,恢复后仍给予饮食控制,每只每天12-14g,饮水不限,以保持体重。4、Catwalk的数据采集：Catwalk的数据采集时间分别为：所有大鼠在Catwalk训练合格后采集作为基线；立体定向手术后4周再次进行Catwalk自动步态分析检测。6-OHDA+电极组大鼠在PPTg-DBS前后分别进行Catwalk数据采集。5、PPTg-DBS:6-OHDA+电极组大鼠在带线关机和带线开机的情况下分别进行Catwalk自动步态检测。刺激参数：频率25Hz,脉宽80us,幅值2-6V。每只大鼠的刺激幅值为个体刺激阈值的80%。每只大鼠从2V开始给予刺激,每0.1V向上调,直到出现刺激副作用时(比如,大鼠身体扭转至一侧或者头部抖动等)的幅值为个体的刺激阈值。6、组织化学：全部的步态检测后,大鼠常规麻醉,并通过刺激电极接通刺激器,给予强电压通电,使得电极尖端在脑组织上留下针道痕迹,以便确定刺激电极的尖端的位置。开胸心脏灌注生理盐水冲洗,灌注4%多聚甲醛溶液固定,取脑组织置于4%多聚甲醛浸泡固定过夜,再置于25%蔗糖溶液中脱水,直至脑组织完全下沉。固定及脱水后的脑组织里进行冰冻切片,取黑质部和中脑脚桥被盖核处的切片分别进行TH免疫组化染色和尼氏染色以确定黑质多巴胺能神经元毁损情况和电极是否植入脚桥被盖核位置。7、统计学方法：采用SPSS19.0统计软件分析数据,计量资料用“均数±标准差”表示,两组均数间的比较采用两独立样本t检验；立体定向术前后的次数比较和PPTg-DBS前后的均数比较采用配对样本t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。结果：1、假手术组大鼠在立体定向术前和术后4周相比较,四只脚爪的步幅、摆动速度、支撑相时间、最大接触面积时间比率、最大接触面积、平均压力的这些参数的差异无统计学意义(P>0.05)；反应四只脚爪协调性的支撑基数、正常步序模式、行走支撑模式、规律指数的这些参数也没有统计学差异(P>0.05)。2、6-OHDA组与假手术组相比较,四个脚爪的步幅、摆动速度减小了,支撑相时间和最大接触面积时间比率增加了,差异均有统计学意义(P<0.05)；但是,最大接触面积和平均压力这两个参数只有在患侧(左侧)前后脚爪减小了,有统计学差异,而健侧(右侧)前后脚爪的这两个参数的差异无统计学意义(P>0.05)。前脚爪的支撑基数的差异无统计学差异(P>0.05),而后脚爪的支撑基数变大,有统计学差异(P<0.05)。反应四只脚爪的协调性的正常步序模式、行走支撑模式、规律指数的这些参数的差异没有统计学意义(P>0.05)。3、6-OHDA+电极组与6-OHDA组相比较,四只脚爪的步幅、摆动速度、支撑相时间、最大接触面积时间比率、最大接触面积、平均压力的这些参数的差异无统计学意义(P>0.05)；反应四只脚爪协调性的支撑基数、规律指数的这两个参数差异无统计学意义(P>0.05)；但是,正常步序模式、行走支撑模式的差异有统计学差异(P<0.05)。4、6-OHDA+电极组大鼠在PPTg-DBS后与PPTg-DBS前相比较,四只脚爪的步幅、摆动速度提高,支撑相时间、最大接触面积时间比率降低,差异有统计学意义(P<0.05)；患侧(左侧)的前后爪的最大接触面积和平均压力增加,有统计学差异(P<0.05),而健侧(右侧)的这两个参数变化并无统计学差异(P>0.05)。同时,双后肢的支撑基数恢复(P<0.01)；但是,正常步序模式的类型占比、行走支撑模式以及规律指数在PPTg-DBS后并无统计学差异(P>0.05)。结论：1、Catwalk自动步态分析系统能同时检测出偏侧PD模型大鼠步态的动态、静态和肢体间协调的参数变化。2、建立了用于PPTg-DBS研究的偏侧6-OHDA毁损PD大鼠模型。3、PPTg-DBS可以调控PD模型大鼠的步态行为,改善其步态障碍。4、PPTg的电极植入可能影响了偏侧PD模型大鼠的正常步序模式和行走支撑模式,而且一定刺激参数下的PPTg-DBS不能恢复其运动协调性。