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耐有机溶剂极端微生物在双相生物催化转化、环境生物修复、极端酶系开发等领域具有重要用途。耐有机溶剂极端微生物所产生的天然耐有机溶剂酶系如蛋白酶及酯酶在有机溶剂中对某些手性化合物表现出高度的立体选择性，使它们在手性化合物的拆分及催化合成等方面显示出广阔的应用前景。本论文根据耐有机溶剂极端菌产生天然耐有机溶剂酶系的研究现状，将研究重点放在耐有机溶剂极端菌的筛选、高强度耐有机溶剂蛋白酶产生菌的筛选及生物学特征、耐有机溶剂蛋白酶的酶学性质及基因表征等研究。本文的主要研究成果如下：
(1)以环己烷、甲苯、丙酮、丁醇等溶剂为选择压力，从土壤样品中筛选获得43株耐有机溶剂菌。经鉴定，以环己烷、甲苯为选择压力筛选的36株菌，多为革兰氏阴性菌Pseudomonas属细菌；而由丙酮、丁醇混合溶剂筛选的7株菌均为革兰氏阳性菌株，其中5株为Bacillus属细菌。研究了43株候选菌株对10种溶剂(logP-2.03-5.6)的耐受特性，结果表明，革兰氏阴性菌对溶剂的耐受能力普遍高于革兰氏阳性菌株，以辛醇、十二醇为代表的长链烷醇对革兰氏阳性菌的细胞毒性尤为显著。43株耐有机溶剂菌的抗生素耐受性试验显示了明显的规律性，即所有革兰氏阴性菌对氨苄青霉素、四环素、卡那霉素及氯霉素均不敏感，而革兰氏阳性菌对上述4种抗生素均敏感，这一现象可能与细胞壁膜的通透性差别或膜蛋白特性有关。
(2)从43株耐有机溶剂极端菌筛选耐有机溶剂蛋白酶产生菌，获得8株菌株能相对高产胞外蛋白酶。其中2菌株所产胞外蛋白酶具有对高浓度亲水溶剂(二甲基亚砜(DMSO)，二甲基甲酰胺(DMF))稳定的特质，分别为Bacilluslicheniformis YP1和Pseudomonas aeruginosa YYP6，其中Bacillus licheniformisYP1为首次报道产溶剂稳定性蛋白酶的菌株，用于后续的研究。
(3)溶剂可显著影响YP1菌株产胞外蛋白酶的能力。烷烃溶剂的碳链长度对YP1菌株产酶呈现了显著差异，正庚烷、正辛烷、正癸烷等溶剂显著抑制YP1产蛋白酶，而十二烷、十四烷、十六烷能显著促进蛋白酶分泌产量提高1倍以上。烷醇均能显著抑制YP1产胞外蛋白酶，C6以上的烷醇溶剂对YP1菌株的细胞毒性显著高于相应的烷烃溶剂。分析十四烷和十二醇对YP1细胞形态的影响可见，十四烷存在下能增加细胞的比表面积，而十二醇存在下导致了细胞比表面积的减小，推测与溶剂的细胞毒性差异有关。
(4)分离纯化得到电泳纯的YP1耐有机溶剂蛋白酶，并对其酶学性质进行了表征。通过硫酸铵沉淀、疏水及强阳离子交换层析，得到电泳纯的YP1蛋白酶，比活力提高了37.2倍，总蛋白回收率达20％。分离纯化产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)显示亚基分子质量约为28 kDa，以酪蛋白为底物时，YP1蛋白酶的Km为0.048g/L。纯化的YP1蛋白酶对高达50％(v/v)浓度的12种有机溶剂具有高度的稳定性，尤其对亲水性溶剂DMF和DMSO的最大耐受浓度分别高达55％和65％(v/v)，揭示其具有良好的有机相催化潜力。YP1蛋白酶在pH8.0-13.0内的具有较高活力和稳定性，最适反应pH为10.0，为迄今报道的最耐碱的溶剂稳定性蛋白酶；YP1蛋白酶最适反应温度为55℃，45℃以下时具有良好的稳定性。还原剂对酶活有轻微的抑制作用，低浓度变性剂尿素(Urea)对酶活具有较强的促进作用。YP1蛋白酶具有丝氨酸蛋白酶和金属蛋白酶的特性，对表面活性剂Triton、SDS、Tween等均具有较强的抗性。YP1蛋白酶的耐碱特性及对表面活性剂的抗性，揭示其具有洗涤剂添加领域的应用潜力。
(5)克隆了YP1耐有机溶剂蛋白酶基因，并在Bacillus subtilus WB800中进行表达，验证了表达蛋白的溶剂耐受性。克隆了包括启动子、信号肽的蛋白酶基因，B.licheniformis YP1碱性蛋白酶的阅读框与B.licheniformis ATCC14580菌株碱性蛋白酶kerA的碱基同源性为96.4％，氨基酸同源性为98.7％，其氨基酸突变位点共有5个，其中Glu85→Lys85的改变发生在YP1蛋白酶的前肽序列，成熟蛋白酶的氨基酸变化共有4处，分别为Tyr126→Phe126，Asn199→Ser191，Pro233→Ala233，Ser316→Asn316。采用枯草杆菌克隆载体pHY300PLK，利用YP1蛋白酶自身的启动子、RBS、信号肽、前肽、成熟肽等功能序列在B.subtilus WB800中进行了表达，重组菌能正确识别并分泌表达YP1蛋白酶，培养基上清中蛋白酶活力高达150U，是含有pHY300PLK空载体对照菌株蛋白酶活力的8-10倍，重组菌所表达的蛋白酶对多种50％(v/v)的亲水或疏水溶剂均有良好的耐受性。耐有机溶剂YP1蛋白酶编码基因的克隆和表达为进一步从分子机理上研究酶的溶剂耐受机制奠定了基础。