论文部分内容阅读
乳酸菌胞外多糖(Lactic acid bacteria exopolysaccharide,LAB EPS)是指乳酸菌在生长的过程当中代谢到体外的一种生物大分子聚合物。乳酸菌胞外多糖具有良好的物理特性和生物活性,成为了近些年的研究热点。某些乳酸菌菌株所产的胞外多糖能够抑制肿瘤细胞的增殖,也具有抗氧化生物活性。本论文研究了实验室所保藏的4株乳酸菌L.plantarum 12、L.plantarum 14、L.plantarum 32、L.plantarum 37所产的胞外多糖,筛选出对人结肠癌细胞Caco-2的增殖抑制作用效果最强的一种胞外多糖,确定这种胞外多糖产量最大时菌株的培养条件,然后分离纯化这种胞外多糖,研究纯化后单一组分的理化性质以及其初级结构。首先采用MTS法对实验室所保存的4株乳酸菌L.plantarum 12、L.plantarum 14、L.plantarum 32和L.plantarum 37所产的胞外多糖进行抑制肿瘤细胞增殖效果的测定。结果显示,L.plantarum 12所产的胞外多糖对Caco-2细胞增殖的抑制率最高,可达到42.1%,L.plantarum 14、L.plantarum 32和L.plantarum 37所产的胞外多糖对Caco-2细胞增殖的抑制率分别为14.1%、32.6%和22.5%,所以选定L.plantarum 12所产的胞外多糖作为后续实验的研究对象。其次采用单因素实验和正交试验对L.plantarum 12产胞外多糖的培养条件(碳源种类和浓度、培养时间、培养温度、培养基初始pH、接种量)进行优化,最后得L.plantarum12产多糖的最佳培养条件为:碳源选择为蔗糖,碳源浓度为4%,培养温度为37℃,培养液的初始pH为7.0,培养时间为24 h。验证实验结果表明在此条件下12号多糖的产量高于正交试验中任意一条件组合的糖产量。然后采用优化过的培养条件提取12号多糖,先用DEAE-Sepharose Fast Flow离子柱对12号粗多糖进行分离纯化,得到2个组分,再利用Sepharose CL-6B凝胶柱对分离出的两个组分进行进一步纯化,最后得到两个单一组分EPS12-1、EPS12-2。利用蛋白纯化仪测定出标准品分子量与洗脱体积之间的线形关系和两种组分的洗脱体积,计算出两个组分的分子量均为3.58×10~5 Da。最后检测两种多糖组分的纯度,对其理化性质及结构进行研究。对纯化后的两个单一组分EPS12-1、EPS12-2进行紫外全波长扫描,紫外扫描结果表明:两个单一组分在260 nm和280 nm都没有吸收峰,可以说明两种组分中不含核酸和蛋白质。采用间羟基联苯法和硫酸钡浊度测定法测定两种组分的糖醛酸含量和硫酸基含量,测定结果显示,在EPS12-1中未检测出糖醛酸和硫酸基,EPS12-2中糖醛酸的含量为4.6%,硫酸基的含量为8.9%。采用高效液相色谱测定12号多糖的单糖组成,通过与4种标准品(鼠李糖,木糖,果糖,葡萄糖)的保留时间进行对比,发现12号粗多糖中所含的单糖种类为葡萄糖。对两种组分EPS12-1、EPS12-2进行红外光谱扫描分析得出,两种组分EPS12-1、EPS12-2均存在多糖典型的特征吸收峰。