背景胚胎干细胞(embryonic stem cells, ES cells)来源于囊胚的内细胞团(Inner Cell Mass, ICM)细胞和原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs);诱导多能性干细胞(Induced Pluripotent Stem Cells, iPS cells)]是由成体细胞逆转而成的具有与ES细胞类似全能性的细胞,二者均有无限增殖、自我更新和多向分化潜能,能够向不同的组织细胞分化。ES细胞及iPS细胞体外培养极易自发分化,必须在培养基中加入分化抑制因子或者将其培养在饲养层细胞上。单独的细胞因子抑制其分化效果不理想,目前多数实验研究采用丝裂霉素C处理小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast, MEF)来制备饲养层。虽然已有无饲养层培养体系的报道或应用人胎盘成纤维细胞建立人类ES细胞系,但小鼠胚胎成纤维细胞作为ES细胞培养最常用的方法,取材方便,成本低廉,且能分泌细胞因子有效的抑制ES细胞及iPS细胞自发分化和促进其增殖,MEF作为饲养层能有效地促进ES细胞及iPS细胞增殖并维持其未分化特性和多潜能性,且效果优于无饲养层单独添加一些细胞因子,而且可以为ES细胞及iPS细胞提供类似的胚胎发育环境,因此在研究ES细胞及iPS细胞时得到广泛的应用。本实验以ICR品系小鼠为实验材料,对MEF的分离培养和饲养层的制备的最佳条件进行探索,并验证制备的饲养层细胞支持干细胞生长的效果,为后期进一步研究ES细胞及iPS细胞提供实验基础。目的建立稳定高效的ICR小鼠胚胎成纤维细胞饲养层体外培养体系,优化小鼠胚胎成纤维细胞的分离方法及饲养层的制备方法,探索稳定的ICR小鼠胚胎成纤维细胞分离的条件,以及胚胎干细胞饲养层细胞制备的最佳方法,建立符合自身实验条件的干细胞体外饲养层培养体系,对课题组今后的实验提供实践基础,为同类实验对实验条件进行规范化提供依据。方法1.使用胰蛋白酶消化法体外分离MEF,利用不同浓度胰蛋白酶消化ICR小鼠胚胎组织不同时间,在显微镜下观察不同实验组细胞形态,贴壁快慢,记录获取原代细胞数量、苔酚蓝染色检测分离原代细胞培养12h后的存活率等,优化胰蛋白酶消化法体外分离ICR小鼠胚胎成纤维细胞的最佳实验条件。2.对第2至第7代MEF的生长状态,增殖活力进行比较,观察其光学显微镜下细胞形态,细胞计数观察其增殖速度,并使用统计图描述各组细胞生长曲线,探索第几代细胞最适合制备饲养层。为饲养层细胞的制备提供理论依据。3.选择第3代MEF,利用5%、10%、15%、20%不同血清浓度培养基进行培养,每天每个实验组取5个样本进行细胞计数以检测细胞增殖速度,用统计图描述各组细胞生长曲线,统计数据先做方差齐性检验,若方差齐,采用单因素方差分析(One-way ANOVA)险验各实验组是否存在显著差异,如果存在显著差异,则进一步使用LSD法做组间两两比较；若方差不齐,用Welch检验法检验组间是否存在显著性差异,若组间存在显著性差异,则进一步使用Dunnttt T3法检验组间的差异。探索MEF体外培养的最佳血清浓度。4.选择第3代细胞制备饲养层,利用不同浓度的丝裂霉素C (5ug/ml, 10ug/ml,1 5ug/ml,20ug/ml)处理MEF不同时间(1h、2.5h、3.5h)后,使用MTT法检测其培养的3、6、8天细胞活力,酶联仪上检测各实验组MEF在570nm处的吸光度OD值,将相同实验条件下(丝裂霉素C浓度及处理时间)的样本以培养时间分组,利用Levene方法做方差齐性检验,若方差齐,则用One-Way ANOVA检验组间是否存在显著差异；若方差不齐,则用Welch法检验组间是否存在显著差异。确定制备饲养层细胞的最佳方法。并利用荧光法检测制备的饲养层细胞有无支原体感染。5.利用MEF制备饲养层培养人胚胎干细胞及诱导多能性干细胞,观察干细胞在饲养层上的生长状态,根据倒置纤维镜下观察分化细胞在克隆中所占的比例,将hES细胞及iPS细胞克隆分为未分化(分化细胞占克隆细胞比例≤20%)和分化(分化细胞占克隆细胞比例≥20%)两类,实验取3复孔计算hES细胞及iPS细胞分化与未分化克隆数,分析饲养层细胞支持hES细胞及iPS细胞生长状况及观察细胞分化情况,同时利用RT-PCR检测其干细胞标志基因Nanog、OCT-4的表达,验证制备的饲养层细胞支持干细胞生长的效果。7.统计方法：运用SPSS13.O统计软件进行统计分析,所有数据均以均数或者均数士标准差(X±S)表示。不同代次细胞的生长情况使用统计图描述；不同血清浓度对MEF增殖的影响用,用统计图描述各组细胞生长曲线,统计数据先做方差齐性检验,若方差齐性,采用单因素方差分析(One-way ANOVA)检验组间是否存在显著差异,如果存在显著差异,则进一步使用LSD法做组间两两比较；若方差不齐,用Welch检验法检验组间是否存在显著性差异,若组间存在显著性差异,则进一步使用Dunnttt T3法检验组间的差异。饲养层的制备各实验组MTT比色法结果先做方差齐性检验,若方差齐性,采用单因素方差分析(One-way ANOVA),若方差不齐,用Welch检验法。结果1.光学显微镜观察可见MEF在体外成贴壁生长,呈长梭形、多边形或不规则星形等形状,排列成漩涡状、栅栏状等,细胞大小不均匀,异质性较大,有卵圆形核,随着传代次数增加,杂质细胞减少,细胞成分逐渐趋向单一化。2.胰蛋白酶消化ICR小鼠胚胎组织的效果与胰酶的浓度及时间相关：使用0.05%浓度的胰蛋白酶消化12-15分钟对细胞损伤最少,获取细胞数量最多,每个胚胎组可获取106个以上细胞,且细胞存活率达80%以上；0.15%浓度胰蛋白酶消化8-10分钟每个胚胎组织获取细胞数量大于105少于106,原代细胞存活率在60%-80%之间；0.25%胰蛋白酶浓度组获取细胞数量最少,少于105个／胚胎,细胞存活率低,不足60%。因此胰蛋白酶浓度越低,则对从组织块分离的细胞作用越温和,对其损伤越小,虽然胰蛋白酶浓度低需要延长消化时间,但可获取的细胞数量越多。3.传代次数对MEF生长的影响：实验对比P2-P7 MEF生长状态,发现MEF在P2-P5时细胞增殖速度快,细胞贴壁快,伸展性好,呈现出典型的成纤维细胞形态：即以长梭形为主,有少部分不规则星形、多边形,卵圆形细胞核,胞质均匀,胞浆颗粒少。MEF传代至第6代以后,细胞质内出现较多的空泡,部分成纤维细胞纤维出现分叉现象,胞体呈现不规则的薄片状,细胞质内颗粒较第5代以前明显增多,细胞之间空隙增大,细胞形态衰老。对比第2-7代MEF细胞增殖情况,发现第2、4、5代细胞在前4-5天虽然呈现增殖趋势,但生长情况不如第3代细胞,且无明显的平台期,第4、5代细胞增殖到峰值后细胞数量显著减小,第6、7代细胞无明显增殖。因此第3代细胞生长状态最好,最适合制备饲养层细胞。4.培养基中血清浓度对MEF生长的影响：5%血清浓度的培养基培养,培养1周时间内,细胞数量变化不大,维持在10000-20000个细胞之间,随着培养时间的延长细胞出现大量死亡；10%、15%、20%血清浓度培养基均可以培养MEF且细胞增殖速度快,但在15%血清浓度培养基组中细胞数量在第4-6天出现平台期,细胞数量相对稳定,而10%及20%血清浓度培养基组细胞数量达到峰值后立即下降,没有出现平台期。利用随机分组方差分析,Levene方差齐性检验(P≥0.05)。LSD进行两两比较发现,四组细胞在接种后第1、2、3天各组间均存在显著差异(P<0.05),各组细胞数量随着血清浓度的增大而增加；第4、5天而15%与20%血清浓度组无显著性差异(P≥0.05),其余各组间比较均存在显著性差异(P<0.05)；第6、7天四组细胞各组间虽均存在显著性差异(P<0.05),但15%血清浓度组细胞数量最大,由图5也可见10%及20%血清浓度组细胞数量较第4、5天减少。因此10%、15%、20%血清浓度培养基均支持细胞增殖,但15%血清浓度培养基组更适合MEF的生长。培养第7天各组细胞图片见(图10-13)5.丝裂霉素C对MEF增殖的抑制效果与其浓度及作用时间均相关。实验数据经方差分析结果表明：丝裂霉素C浓度为10ug/ml,处理2.5小时,各实验组间均数无显著性差异(Levene检验方差齐,P≥0.05, ANOVA分析P≥0.05),其他条件下各实验组间均有显著性差异(Levene检验方差齐,P≥0.05, ANOVA分析P<0.05或者Levene检验方差齐,P<0.05, Welch分析P<0.05)。即使用10ug/ml丝裂霉素C处理MEF2.5小时,能有效抑制细胞分裂同时又不会引起MEF大量死亡,且饲养层细胞能维持8-10左右。6.hES及iPS细胞在饲养层上生长的效果：hES及iPS细胞在丝裂霉素C处理过的MEF饲养层上,经过数次传代,仍保持旺盛的生长能力,增殖迅速并呈典型的类圆形克隆。hES克隆分化的细胞克隆数占5.6%,iPS克隆分化的细胞克隆数占6.6%,大部分细胞保持着未分化状态；RT-PCR表明hES及iPS经过几次传代后仍有较高水平的干细胞标志基因Nanog、OCT-4的表达。结论1.胰蛋白酶消化法分离ICR小鼠胚胎成纤维细胞,经传代培养即可纯化,无需其他的方法纯化MEF,可用于制备饲养层。2.0.05%胰蛋白酶消化鼠胚胎组织12-15分钟为最佳体外分离MEF实验条件。在此条件下,胰酶对细胞损伤最少,获取细胞数量最多,原代细胞存活率高,贴壁及增殖速度快,传代后细胞生长快等。3.MEF体外培养发现含15%血清的培养基最适合MEF的生长。MEF细胞在第3代生长状态最好,最适合制备饲养层细胞。4.丝裂霉素C处理MEF的最佳条件为10ug/ml处理2.5小时,此条件下丝裂霉素C能抑制MEFs增殖,但不会出现大量死亡,且细胞能维持8-10天。5.丝裂霉素C处理过MEF作为饲养层,能有效的支持hES及iPS细胞生长,促进干细胞增殖同时维持其处于持未分化状态。通过RT-PCR检测到干细胞相关基因Nanog及OCT-4的表达。