研究背景性腺作为传递遗传物质的唯一组织，在睾丸中已经证实有生殖系干细胞，即精原干细胞（spermatogonial stem cells, SSCs）的存在，并成功进行了体外培养，通过生精过程产生精子[1]。但是，在卵巢中，雌性生殖干细胞的存在（female germlinestem cells,FGSCs）仍然有争议。传统的观点认为：卵母细胞的数量在出生后的数量是固定存在的，雌性哺乳动物卵泡池中不存在一种能增殖的生殖细胞[2,3,4]。这一观点持续了半个多世纪，然而，在2004年Johnson等[5]经过测定小鼠不同天数未闭锁卵泡数和闭锁卵泡数，发现卵泡闭锁的发生率要高于卵泡数量的减少率，因此推测卵巢组织内存在有增殖活性的生殖细胞，这一观点打破了传统观的生殖细胞的理论。在其后，不同的学者纷纷利用不同的方法进行反复的验证，其中最有意义的是Zou等[6]通过MVH标记进行磁珠分选，获得的生殖细胞进行体外培养，发现其具有增殖的潜能，转染GFP标签后原位移植生殖细胞毁损鼠，与雄性交配后产下正常的转基因GFP小鼠。White等[7]成功通过流式细胞(FACS)分选小鼠和人类的GSCs，又通过GFP标记GSCs，移植至小鼠卵巢内，获得GFP阳性的卵母细胞。然而有些学者仍然坚持着传统的观点，Zhang H等[8]通过内源性的基因的方法和多种荧光Rosa26，Ddx4-Cre体外追踪生殖干细胞的方法，结果未发现表达Ddx4有增殖活性的生殖细胞。因此，卵巢组织内是否存在FGSCs，仍然存在着巨大的争议。本研究试图通过定位小鼠卵巢内增殖的生殖细胞，再联合胶原酶和胰酶消化卵巢及利用差异贴壁法进行细胞的分离纯化，采用与SSCs相似的培养条件进行培养细胞，并利用卵泡液的性质寻找FGSCs的分化能力，并鉴定其生物学特性。目的分离、培养、鉴定卵巢中的雌性生殖干细胞，并进一步探讨其分化能力，为生殖干细胞的存在提供证据。方法1）利用Brdu和MVH双标免疫荧光定位体内具有增殖活性的生殖细胞；2）取2~5d新生鼠卵巢组织，胶原酶、胰蛋白酶联合消化获得单个细胞悬液，取12.5d孕鼠的胎鼠获得胚胎成纤维细胞（MEF），以5×104个/mL，接种于24孔培养板，做为饲养细胞，添加不同生长因子的α-MEM培养基培养细胞，观察细胞的形态；3）免疫荧光及组化检测培养细胞的干细胞标记物Oct4、SSEA-1，生殖细胞标记物MVH，Brdu-MVH双标的表达；4）向处于减数分裂时的细胞中添加人卵泡液，观察细胞的分化形态；并鉴定其分化功能；5）RT-PCR检测生殖细胞MVH，Dazl，透明带基因Zp1、Zp2、Zp3的表达，干细胞基因Oct4，联会复合体基因SCP3的表达。结果1）卵巢上皮存在着Brdu/MVH双标表达阳性的细胞；2）体外分离培养2d形成散在的小而圆形或卵圆形的细胞，多数处于分裂状态，随着培养的延长细胞聚集成簇；3）免疫组化及荧光显示SSEA-1，Oct4和Brdu/MVH双标表达阳性，碱性磷酸酶染色阳性；4）诱导分化后，SCP3表达，RT-PCR显示Oct4表达降低，MVH，Dazl，ZP1，ZP2，ZP3表达升高。结论小鼠卵巢组织中存在FGSCs，在体外能够成功培养，且可诱导分化为卵母细胞。