甘蓝（Brassica oleracea L.）是我国重要的蔬菜作物,也是世界各国广泛种植的叶用类蔬菜作物之一。我国每年栽培面积可达90万hm²,在蔬菜周年均衡供应中占有重要地位。甘蓝是典型的异花授粉植物且具有显著的杂种优势特点,育种家主要通过自交不亲和系配制杂种一代,但自交不亲和的特点使其繁殖需要蕾期人工授粉,不仅效率低、费时费力、成本高,而且会因自交不亲和造成结实率低产量少的问题,以上因素都严重制约了育种人员对甘蓝农艺性状的改良进程。近年来,CRISPR/Cas9（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9）系统得到了广泛应用,其作为一种新的基因编辑工具,具有操作简单、成本低、周期短的优点,在定向改造植物基因组上表现出了巨大的潜力。目前已经成功实现了在水稻、小麦、拟南芥、烟草等植物中的基因定点编辑,近两年CRISPR系统在甘蓝上也得到了成功应用,但尚不成熟。本研究利用CRISPR/Cas9技术敲除甘蓝八氢番茄红素脱氢酶BoPDS基因、SRK基因,以期获得基因编辑的甘蓝植株,为建立简便高效的甘蓝CRISPR/Cas9基因编辑体系及新种质创制的应用奠定坚实的基础。本论文的主要研究结果如下:1.甘蓝原生质体制备体系优化及瞬时转化体系的建立。对甘蓝原生质体制备体系优化的结果表明:使用由1%纤维素酶+0.5%离析酶+0.6 mol/L甘露醇+10 mmol/L MES+1 mmol/L CaCl₂+0.1%BSA+5 mmol/Lβ-巯基乙醇组成的酶解液,摇床温度为26℃,转速为60 r/min,黑暗条件下酶解6 h后,500 g/min离心5 min收集细胞,原生质体产量约为3.0×10⁶个/g,活力约为90.9%;以分离纯化的原生质体为转化对象,在浓度为20%的PEG4000介导下,将带有绿色荧光蛋白的载体（PYBA 1132）分别转入从甘蓝下胚轴、子叶、叶球分离获得的原生质体中,转化效率分别为为43%、35%、19%,表明下胚轴分离获得的原生质体最适于瞬时转化。同时以下胚轴分离获得的原生质体为受体,分别转化线粒体特异表达载体COX和质体特异表达载体969,也观察到了荧光信号,成功建立了甘蓝原生质体瞬时转化体系。2.利用甘蓝原生质体瞬时转化体系检测sgRNA的靶向能力。本研究结果表明PDS基因在靶点1和靶点2附近的序列中有碱基替换和插入,靶点1的PAM序列后第7个碱基处发生替换,由T碱基变为G碱基;靶点2附近有两种碱基插入类型,第一种是PAM序列前面有一个T碱基插入,第二种是PAM序列前面第3位和第6位出现了两个碱基插入,编辑效率为12.5%。SRK基因在靶点1附近的序列有碱基缺失和碱基插入两种编辑类型,靶点2未发生编辑,第一种编辑类型为靶点1的PAM序列前第4个碱基至第7个碱基发生缺失;第二种编辑类型为靶点1的PAM序列前第4位插入一个C碱基,编辑效率约为10%。3.CRISPR/Cas9技术定点敲除甘蓝基因体系的建立。将构建好的PBSE401-BoPDS-CRISPR和PKSE401-SRK15-CRISPR表达载体通过农杆菌介导法侵染甘蓝子叶,对抗性植株的靶序列测序分析,结果发现:BoPDS基因未检测到靶点的突变。针对35株PKSE401-SRK15-CRISPR的T0代转基因植株SRK基因靶向区域的PCR片段测序结果表明,有3株在靶位点1发生编辑,0株在靶位点2发生编辑,编辑效率约为10%。进一步的克隆测序分析显示,在靶点1,敲除效率为75%。