条斑紫菜质外体锰超氧化物歧化酶的基因表达分析

来源 :中国海洋大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:sakuma556
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条斑紫菜是世界栽培海藻中最具经济价值的红藻之一,同时也是潮间带海藻的模式物种,是开展藻类遗传学、抗逆分子生理学和基因组学研究的理想材料。本论文以条斑紫菜为研究材料,从抗氧化酶——超氧化物歧化酶的基因表达及其酶活变化,探讨紫菜抗逆的分子基础,以期深入了解条斑紫菜适应环境胁迫的分子机制。通过分析预测的条斑紫菜锰超氧化物歧化酶(PyMn SOD; EC 1.15.1.1)氨基酸序列,找到了Mn SOD所具备的特征氨基酸;利用Native-PAGE和SOD对不同抑制剂敏感的特性,确定了条斑紫菜中仅含有Mn SOD。将本实验室克隆的PyMn SOD全长cDNA与原核表达载体pET-30(+)连接,构建重组表达质粒pET-S;转化大肠杆菌BL21(DE3)表达PyMn SOD,表达产物的分子量大小约为30 KDa,部分可溶性蛋白具有特异性SOD活性,部分以不可溶的包涵体形式存在。研究确定了重组蛋白的最佳诱导表达条件:培养温度25℃,诱导时间4h。利用不同浓度的Mn2+诱导重组PyMn SOD的表达,可以检测到比活力随Mn2+浓度增高而上升的趋势。表明Mn2+对于提高Mn SOD的活性具有一定的促进作用。条斑紫菜两种世代的SOD比活力测定发现,配子体(叶状体)的SOD比活力比孢子体(丝状体)的高,是其2.68倍,表现出了两种世代对于环境的适应性。Native-PAGE活性染色研究发现,条斑紫菜仅含有一种类型的SOD,即Mn SOD,与一些原核的蓝藻和厌氧菌类似,说明条斑紫菜抗氧化系统仍处于原始的方式。用重组PyMn SOD免疫两只新西兰大白兔,制备了多克隆抗体,间接酶联免疫吸附实验(ELISA)检测到多克隆抗体的效价为1:8000,免疫印迹实验(Western Blotting)表明该多克隆抗体具有很好的特异性。为了研究PyMn SOD的细胞定位,利用免疫胶体金标记技术发现PyMn SOD定位于质外体中,并且在两个世代中没有差异,表现出与高等植物质外体SOD定位的相似性。为了研究PyMn SOD在条斑紫菜配子体(叶状体)处于失水胁迫中的作用,我们对其进行失水与复水处理,测定了PyMn SOD的活性并且分析了表达量,结果表明条斑紫菜配子体(叶状体)处于失水胁迫时,主要通过提高增强比活力的途径来起到清除O2·-的作用,其中比活力提高了2.67倍,说明了PyMn SOD在保护质膜免受O2·-损害的重要作用;并且确定了丙二醛作为衡量条斑紫菜配子体(叶状体)失水胁迫程度的指标。
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