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背景:可卡因是一种能够强化中枢神经系统兴奋作用的成瘾性药物,可卡因滥用造成严重的全球性社会问题和健康问题。可卡因在体内的主要代谢产物苯甲酰芽子碱（benzoylecgonine,BE）与可卡因拥有相似的毒性作用。然而,BE在人体内循环时间更长,并产生更加持久的毒性作用。若想达到完全消除可卡因毒性作用的结果,所开发的药物不仅需要消除可卡因自身毒性作用,还需消除其代谢产物BE的毒性。国外前期研究中发现的一种在古柯植物周围土壤中生存的红球菌（Rhodococcus sp.）中提取到的可卡因酯酶（Cocaine esterase,CocE）可有效水解可卡因生成无生物活性的芽子碱甲酯和苯甲酸。然而,本实验室前期研究发现CocE对BE也具有微弱活性(kcat=301 min-1,KM=5153μM),能催化BE生成无生物活性的芽子碱和苯甲酸。以此为线索,本实验室设计开发了五重突变体CocE-5M显著提高了对BE的催化活性(kcat=576.4 min-1,KM=40.4μM)。目的:苯甲酰芽子碱代谢酶CocE-5M具有进一步的开发价值,有望为解决可卡因滥用与苯甲酰芽子碱毒性问题提供方案。基于此,本课题研究目的如下:1.研究苯甲酰芽子碱代谢酶CocE-5M的稳定性。2.研究苯甲酰芽子碱代谢酶CocE-5M的三维蛋白晶体结构,阐明CocE-5M对BE的催化机理,为进一步开发CocE-5M对BE的催化活性奠定基础。3.探讨苯甲碱芽子碱代谢酶CocE-5M对胆碱能神经系统的影响,分析CocE-5M在临床应用的安全性。方法与结果:1.通过高效液相色谱进行酶活标定,以此确定不同批次CocE-5M蛋白酶的活性差异。结果显示,不同批次纯化的CocE-5M对BE的催化效率无显著差异,CocE-5M催化BE的酶动力学参数为kcat=576.4 min-1,KM=40.4μM,kcat/KM=1.43×10~7 M-1 min-1。相较于野生型CocE对BE催化效率(kcat/KM=5.8×10~4 M-1 min-1)提高247倍。2.通过高通量的坐滴式汽相扩散法筛选并优化CocE-5M蛋白质晶体,获得可结晶条件:0.1 M MES pH 6.5,1.6 M AMS;以初筛可结晶条件为基础,通过改变盐种类、沉淀剂种类及浓度、pH值及不同类型添加剂等,进一步优化结晶条件,得到质量较好的CocE-5M apo-form晶体并测得三维结构。以此为基础,构建并大量表达CocE失活突变体CocE-5M/S117A,与底物BE混合孵育后培养得到复合物晶体并解析结构。采用分子置换法（Molecular Replacement,MR）,以CocE晶体结构（PDB ID:1L7Q）为模板解决相位问题并搭建三维结构模型。所得CocE-5M晶体结构数据分辨率为1.709（?）,空间群P6522,晶胞大小a=b=106.148（?）,c=222.208（?）,α=90.000°,β=90.000°,γ=120.000°,数据完整性98.6%。电子云密度显示晶体体系中水分子及氨基酸侧链清晰可见。CocE-5M与BE复合物样品结构解析后发现底物结合口袋内只有BE代谢物苯甲酸。据此推测突变体CocE-5M/S117A仍然对BE有催化活性,并通过体外酶活反应证实。3.测定CocE-5M对ACh类似物ATC、BTC的体外催化活性。通过Ellman比色法测得野生型CocE催化ATC的酶动力学参数值为kcat=4695 min-1,KM=4.489 m M,kcat/KM=1.05×10~5 M-1 min-1;催化BTC的酶动力学参数值为kcat=6561 min-1,KM=4.225 m M,kat/KM=1.55×10~6 M-1 min-1。与此相对比,CocE-5M催化ATC的酶动力学参数值为kcat=251.8 min-1,KM=86.16 m M,kcat/KM=2.92×10~3 M-1 min-1,催化BTC的酶动力学参数值为kcat=178.8 min-1,KM=1.434 m M,kcat/KM=1.25×10~5 M-1 min-1。以CocE-5M对BE的催化效率为参照,CocE-5M对ATC的相对催化效率是对BE的1/5000,对BTC的相对催化效率是对BE的1/111。因此,CocE-5M对ATC、BTC体外催化结果显示CocE-5M对胆碱能神经系统可能无显著影响。结论:本研究通过CocE-5M的三维结构信息阐明了CocE-5M通过引入V116K突变稳定了酶活性构象,在不影响催化速率(kcat=576.4 min-1)的前提下,增强了对BE的亲和力（KM=40.4μM,提高128倍）,从而提高了对BE的催化效率。同时,本研究准确测定了CocE-5M对乙酰胆碱类似物ATC、BTC的体外催化活性,表明其对胆碱能神经系统无显著影响,为进一步设计新的高催化活性突变体奠定基础,同时对CocE应用于临床可卡因解毒治疗提供了重要参考。