研究背景人工关节置换术是目前治疗晚期骨关节疾病的有效方法,其能有效的解除关节疼痛、恢复关节活动功能,提高患者生活质量。目前全世界每年超过200万人接受人工关节置换术,其中行翻修手术者达到了20%左右。关节置换术后感染、假体无菌性松动、假体周围骨折、关节不稳定和关节活动受限等是关节置换术后需要翻修的常见原因。其中关节假体周围骨溶解引起的假体无菌性松动(aseptic loosening)是影响人工关节使用寿命的主要原因之一。随着关节置换术在临床上的广泛应用以及时间的推移,关节置换术后翻修的患者越来越多,假体周围骨溶解引起的假体无菌性松动作为影响人工关节使用寿命的主要原因之一,其越来越受到关注。假体无菌性松动晚期患者,为解除疼痛和提高生活质量,必须行关节翻修手术。患者要面对难度大、风险高及费用多等问题。如何能找到一种非手术方法来预防和治疗假体周围骨溶解已成为非常迫切和现实的问题。骨组织正常结构功能的维持是个动态平衡过程,这一平衡由骨形成代谢和骨吸收代谢组成,一定量骨吸收后会有等量的骨形成。RANKL/RANK/OPG系统是破骨细胞分化、激活和凋亡过程中的一个重要信号调节系统,这一系统不仅参与调节生理性骨重建,也与病理状态下多种骨病的发生密切相关。核因子K B受体活化因子配体(recetor activatorof nuclear factor к в ligand,RANKL)与核因子K B受体活化因了(recetor activatorof nuclear factor к в, RANK)相结合,诱导破骨细胞分化,促进溶骨。骨保护素(Osteoprotegerin, OPG)可抑制RANKL的作用,抑制破骨细胞活化,促进成骨。成骨细胞和骨髓基质细胞在生理状态下表达一定量的RANKL,促进破骨细胞的分化和骨吸收,同时又分泌相应数量的OPG,防止骨的过度吸收,因此RANKL/OPG的比例协调是维持局部骨代谢平衡的关键。RANKL/OPG的比例或者RANK信号的失衡成为了许多骨骼疾病的病理基础,表现为过度骨丢失、过度骨形成或者骨的重建紊乱。由此可见,RANKL和OPG对骨吸收是同样重要的因子,RANKL和OPG的平衡失调是导致破骨细胞分化、出现骨溶解、骨量丢失的关键性因素。所以假体周围骨组织中RANKL/OPG的平衡情况可反映假体周围骨代谢情况。人工关节界面之间由于长期的运动摩擦可产生聚乙烯、骨水泥和金属等颗粒。这些磨损颗可释放许多溶骨因子,如：白介素-1β (IL-1β)、白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α (TNF-α)等,这些溶骨因子可刺激破骨细胞的前体细胞RANKL基因的表达,同时抑制OPG的产量,引起假体周围骨组织中的RANKL/RANK/OPG系统平衡失调,RANKL/OPG的比值增加,实现破骨细胞的分化与活化,促进假体周围破骨细胞增殖、减少成骨细胞增殖和细胞外基质分泌,造成假体周围溶骨增加、成骨减少,最终导致假体无菌性松动。由此可见,消除和逆转RANKL/RANK/OPG系统中的RANKL/OPG的比值失衡,可能是治疗假体无菌性松动的靶点。骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)是目前促进成骨作用最强的物质,能诱导细胞向骨及软骨方向转化。BMP属于转化生长因子(transforming growth factor, TGF)-β超家族成员,超过40种BMP已经被发现,其中BMP-2有最高的成骨活性,是体内成骨重要的促进因子,能跨种诱导未分化间充质干细胞向成骨细胞方向增殖和分化,促进成骨。BMP-2调控骨代谢过程中成骨细胞和破骨细胞的分化、增殖与功能活性,并通过自分泌、旁分泌和细胞黏附方式在细胞及细胞间质之间传导信息,调节骨细胞的分化和增殖,在骨重建中发挥重要作用。BMP-2的具体作用途径是：BMP-2在细胞外通过信号转导,在细胞内部和抑制性smad蛋白结合,使抑制性smad蛋白表达上调,这些smad蛋白经磷酸化后转运至核内,调控目的基因与其他转录因子(包含PEBP2-α/Cbfa1),与BMP-2激动的smad蛋白协调诱导成骨细胞表型相关基因的表达,促进成骨细胞分化与增殖。BMP-2参与了骨代谢的各个阶段,诱导骨内、外膜和骨髓基质细胞分化为骨母细胞,加强了骨床再生能力,同时活化或诱导血管周围的间充质细胞分化为软骨和成骨细胞,是骨代谢过程中重要的骨形成因子。近年来关于BMP-2作用的研究越来越多,其在骨代谢过程中的的调节作用越来越受到重视,BMP-2可能是临床防治金属磨损颗粒引起假体无菌性松动的有效方法。本文通过金属磨损颗粒诱导产生模拟假体无菌性松动的大鼠植骨气囊模型,对大鼠植骨气囊模型囊腔内骨片行TRAP染色,用计算机图像分析技术测定骨片破骨细胞染色面积比率,评估骨片中的骨吸收情况；用Western-blot和RT-PCR检测方法检测骨片中RANKL、OPG的表达情况,评估骨片中的骨代谢情况；评价rhBMP-2对模型中骨片的骨吸收情况及RANKL、OPG表达的影响,探究rhBMP-2在防治假体无菌性松动方面的作用。为假体无菌性松动的防治探索一种新的方法。目的1.通过构建大鼠植骨气囊模型和进行不同浓度的rhBMP-2缓释体干预,观察不同浓度rhBMP-2缓释体对气囊内组织的骨吸收情况及RANKL、OPG表达的影响,评估rhBMP-2在动物模型中的抗骨溶解作用。2.初步探讨rhBMP-2在防治假体无菌性松动方面的意义及可行性。方法在实验用的60只SD大鼠中,选取50只(剩余10只作为周围囊腔内骨片供体),随机分成5组(空白组、铬颗粒组、50μg/ml rhBMP-2缓释体+铬颗粒组、100μg/ml rhBMP-2缓释体+铬颗粒组和200μg/ml rhBMP-2缓释体+铬颗粒组),在大鼠腹背部注入过滤后的空气20m1,每2天1次,共3次,构建气囊。1周后,如注射部位无红肿、流脓、硬结及渗出等明显炎症反应,则表示动物气囊模型构建成功。处死另外10只大鼠,取颅骨片,将骨片修整成为约10mm X10mm大小,去除干净周围软组织并注意保护骨片表面骨膜。对气囊模型构建成功的大鼠行腹腔麻醉,麻醉成功后,将修整好的骨片植入气囊中。在植骨气囊模型构建成功24小时后,空白组的大鼠气囊内注入6ml生理盐水,铬颗粒组的大鼠气囊内注入2ml铬颗粒悬液和4ml生理盐水,50μg/ml rhBMP-2缓释体+铬颗粒组、100μg/ml rhBMP-2缓释体+铬颗粒组、200μg/ml rhBMP-2缓释体+铬颗粒组的大鼠气囊内除均注入2ml铬颗粒悬液外,还相应的分别注入超声分散后的50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml rhBMP-2缓释体悬液4ml。正常饲养2周后,处死动物,取囊腔组织。对囊腔内骨片行TRAP染色,采用Image proplus5.0软件测量骨片破骨细胞染色面积比率；用Wester-blot检测方法检测囊腔内组织的RANKL、OPG的表达情况；用Rt-PCR检测方法检测囊腔内组织的RANKmRNA、 OPGmRNA的表达情况；记录各组的相关检测结果,采用SPSS13.0软件行One-Way ANOVA,比较各组均数,以P<0.05表示有显著性差异,评估rhBMP-2缓释体对囊腔内骨片的骨代谢的影响。结果1.囊腔内组织RANKL、 OPG的Wester-blot检测结果提示：RANKL、 OPG在各组动物模型囊腔组织中均有表达。在铬颗粒组囊腔组织中的RANKL、 OPG表达及RANKL/OPG值均明显高于其他4组(均P<0.05)。在3个rhBMP-2缓释体干预组囊腔组织内,RANKL、 OPG的表达及RANKL/OPG值均随着rhBMP-2缓释体浓度增高而递减,组间差异均有统计学意义(均P<0.05)。在空白组和200μg/ml rhBMP-2缓释体+铬颗粒组的囊腔组织内,RANKL、 OPG的表达及RANKL/OPG值均未见明显差异(均P>0.05)。2.骨片行TRAP染色后,Image proplus5.0软件测量骨片破骨细胞染色面积比率的结果显示：各组动物模型囊腔内骨片均可见TRAP染色的破骨细胞。铬颗粒组囊腔内的骨片破骨细胞染色面积比率明显高于其他4组(均P<0.05)。3个rhBMP-2缓释体干预组囊腔内骨片破骨细胞染色面积比率随着rhBMP-2缓释体浓度增高而递减,组间差异均有统计学意义(均P<0.05)。空白组和200μg/ml rhBMP-2缓释体+铬颗粒组的囊腔内骨片破骨细胞染色面积比率相互比较未见明显差异(P=0.844,P>0.05)。3.囊腔内组织RANKL、OPG的RT-PCR检测结果提示：RANKLmRNA、 OPGmRNA在各组动物模型囊腔组织中均有表达。在铬颗粒组囊腔组织中的RANKLmRNA、 OPGmRNA表达及RANKLmRNA/OPGmRNA值均明显高于其他4组(均P<0.05)。在3个rhBMP-2缓释体干预组囊腔组织内,RANKLmRNA、 OPGmRNA的表达及RANKLmRNA/OPGmRNA值均随着rhBMP-2缓释体浓度增高而递减,组间差异均有统计学意义(均P<0.05)。在空白组和200μg/ml rhBMP-2缓释体+铬颗粒组的囊腔组织内,RANKLmRNA、 OPGmRNA的表达及RANKLmRNA/OPGmRNA值均未见明显差异(均P>0.05)。结论1.铬颗粒可以引起大鼠植骨气囊模型组织内的RANKL/OPG值升高,促进溶骨。大鼠植骨气囊模型成功的模拟了人工关节无菌性松动的生物学和组织学特征。2.实验结果中RANKL/OPG值与骨片破骨细胞染色面积比率存在的正相关性,又一次证明了RANKL/RANK/OPG系统的RANKL/OPG值可反映骨代谢过程中的骨代谢情况。3.在一定浓度范围内,rhBMP-2缓释体能显著降低大鼠植骨气囊模型组织内的RANKL/OPG值,起到促进成骨、抑制骨吸收的作用。