恩拉霉素A组分单克隆抗体的制备及ic-ELISA快速检测方法的建立

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恩拉霉素属于环状多肽类抗生素,作为抗生素生长促进剂(AGP)在畜禽养殖中被广泛使用,但在养殖过程中的非法添加,会使抗性基因随着食物链蓄集到人体,导致多重耐药菌(MDR)的出现,从而使人体产生耐药性,造成不可逆的后果。中国目前仅规定了饲料中恩拉霉素的添加量,日本和韩国则明确规定了可食性动物组织中恩拉霉素的最大残留量(MRL)为30μg/kg。目前用于动物源性食品中有害物质残留的检测技术主要包括仪器分析技术和免疫分析技术,仪器分析技术如色谱法样本处理繁琐费时,需要专业人员操作;免疫分析技术主要有酶联免疫分析方法(ELISA)和胶体金法,主要优点是检测时间短,样品通量高。目前没有关于恩拉霉素残留检测的免疫分析法报道,因此本研究开发了基于高敏感性和特异性的单克隆抗体的间接竞争酶联免疫吸附法(ic-ELISA)来检测动物性食品中的恩拉霉素残留,主要成果如下:(1)恩拉霉素人工抗原的合成与鉴定通过滤纸片法鉴定恩拉霉素A组分(Er-A)和恩拉霉素B组分(Er-B)的生物活性。将生物活性更高的Er-A通过戊二醛法和羰基二咪唑法分别和BSA,OVA偶联,制备免疫原和包被原,并通过紫外、红外光谱扫描和SDS-PAGE进行了鉴定。(2)抗恩拉霉素A组分单克隆抗体的制备与鉴定用合成的免疫原免疫BALB/C小鼠,获得了高纯度,高特异性的单克隆抗体,对异源包被原和抗体浓度进行优化,产生的抗体(2H1F91)效价为32000,敏感性较好,IC50值为108.5 ng/mL。与Er-B,恩拉霉素混合物的交叉反应率分别为91.4%和97.8%,与其它五种多肽类抗生素(多粘菌素A,多粘菌素B,杆菌肽A,维吉尼亚霉素M1和万古霉素)交叉反应率低于0.01%,表明了产生的单克隆抗体具有高敏感性和高特异性。(3)ic-ELISA方法的优化与建立分别对包被浓度,pH,甲醇浓度,离子强度,一抗二抗反应时间以及显色反应时间进行优化,建立了检测恩拉霉素的间接竞争ELISA方法。最低检测限为12.056 ng/mL,线性检测范围为27.1-434ng/mL。在猪和鸡的肌肉中的最低检测限分别为144.8 μg/kg和98μg/kg。对于猪肌肉样品,Er-A和恩拉霉素混合物的添加回收率分别在94.15%-125.97%之间;对于鸡肌肉样品回收率在71.34%-122.86%之间;变异系数小于12%。同时,建立的ic-ELISA方法与HPLC方法之间良好的线性关系(R2=0.9644)也证明了该方法用于检测动物性食品(猪和鸡肌肉)中恩拉霉素残留是有效且可信赖的。
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