烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR)分子是一种低聚跨膜糖蛋白,分子量大约为290,000 Dalton,由5个同源亚基α2βγδ(胚胎型)或α2βεδ(成人型)组成,形成一个阳离子通道。nAChR存在于神经肌肉接头(NMJ)处,是引起自身免疫性疾病重症肌无力(MG)的自身抗原。肌肉nAChR的乙酰胆碱结合位点和主要免疫原区(MIR)位于α亚基N末端胞外域ECD(α1-210)。抗MIR自身抗体有很高致病力,能导致肌肉中AChR丢失,并激活补体破坏NMJ突触结构,注入大鼠体内能引起严重肌无力症状。但MG抗原调变作用需要多种AChR肽段特异性作用,MIR不是独立唯一的抗原决定簇。故若单独免疫MIR肽段,因为肽段短、免疫位点少、免疫原性弱,不能制备理想的动物模型。普遍的EAMG诱导方法为被动免疫注射MG患者血清或主动免疫电鳐电器官中的AChR。但因MG患者血清采集受限,电鳐不易捕获且价格昂贵,在AChR提取纯化过程中操作复杂效率不高,使得动物模型难以广泛复制。因此,寻找一种简便、易行的诱导EAMG模型的方法就成为了亟待解决的问题。研究发现,抗AChR Ab是高亲和力的IgG ,因此MG的发病机制还与B细胞和CD4+ T细胞有关系。而AChRαECD包含了MIR和AChR特异性T细胞、B细胞表位,用其作为免疫原可以刺激抗原特异性T细胞增殖,激活补体系统。因此,人AChR Hα1-207肽段在EAMG模型制备中具有可行性。TE671细胞属于人神经髓母细胞瘤细胞系,表达功能性的AChRs,即TE671的AChRs能够与MG患者的自身抗体和抗肌肉AChRs-mAb发生交叉反应。TE671细胞中AChR的α亚基与人肌肉AChRα亚基有高度同源性,因此可以通过基因克隆方式重组表达人肌肉AChR的α亚基ECD蛋白替代天然的AChR作为有效免疫原诱导EAMG。90年代初,Talib就应用基因技术克隆了编码人源AChRα亚基细胞外区域1-210残基,并成功在大肠杆菌中表达;Lennon则以该表达产物成功诱导EAMG Lewis鼠模型。随着分子生物学的发展,应用分子克隆和表达技术重组目的基因的方法己非常成熟,本实验在Talib的基础上进行改进,直接从TE671细胞中获得AChR的α1亚基cDNA序列克隆目的片段。用RT-PCR从TE671细胞中扩增出AChRα1亚基全序列,再PCR扩增出ECD基因序列,并将其插入到原核表达载体pET16b。将重新构建的载体转化E .coli BL21(DE3)pLysS,IPTG诱导表达蛋白。得到的包涵体蛋白用Ni2+亲和层析柱纯化,经透析复性后,用ELISA法检测蛋白活性。结果显示PCR产物大小为650 bp,与预计相符;所构建质粒经测序证实ECD核苷酸序列正确,并正确插入载体pET16b。用SDS-PAGE来比较诱导前后蛋白表达情况,发现用IPTG诱导后蛋白表达量大大增加。透析复性后,包涵体蛋白正确折叠且具活性。综上所述,可通过原核表达系统,获得大量正确折叠的可溶性重组人肌肉AChRα1亚基ECD蛋白,使得诱导EAMG模型的方法变得简单快速而价廉,为MG治疗的基础研究提供了一个简便、易行的实验动物模型。