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经皮腔内冠状动脉血管成形术作为治疗冠心病的有效手段,目前已经得到了广泛的应用,但再狭窄的发生却严重限制了它的远期疗效。Krüppel样因子(Krüppel-like factors,KLFs)是一类含锌指结构的转录因子家族,主要参与调节细胞发育、分化、增殖和凋亡等过程。研究表明KLF家族中的KLF4是一种细胞增殖抑制因子,可在血管新生内膜中呈低水平表达。为了探讨KLF4与血管内膜增生的关系,本实验构建了KLF4腺病毒表达系统,将其导入内膜剥脱的颈总动脉壁,观察其在血管中的表达,以及对球囊损伤诱导的新生内膜增生的影响,为揭示KLF4抗内膜增生的分子机制提供实验依据。方法:1重组腺病毒载体的构建首先构建重组穿梭质粒pTOPO-KLF4。将pTOPO-KLF4与腺病毒载pAd在重组酶的作用下,pTOPO-KLF4的attL1-attL2序列与腺病毒载体的attR1-attR2序列发生同源重组。重组子命名为pAd-KLF4。pAd-KLF4和空载体pAd经PacI酶切线性化,暴露出载体的反向终末重复序列,将重组子转染293细胞进行包装,扩增后进行滴度的测定。2球囊损伤模型的复制及分组将SD大鼠(300~350g)常规麻醉消毒,沿颈部正中线切口,暴露左侧颈外动脉,在颈外动脉剪一楔形切口,将球囊导管自切口插入至胸腹主动脉远心端,充盈球囊后反复回拉三次,退出,关闭颈总动脉近心端血流20 min,期间注入20μl pAd-KLF4溶液。结扎颈外动脉,关闭切口。实验动物假手术组、球囊损伤组、pAd组和pAd-KLF4组。3标本的处理于术后14天从股动脉放血处死大鼠,分离颈总动脉,提取颈总动脉RNA,或制备病理切片。结果:1重组子pAd-KLF4的鉴定测序结果表明,pAd-KLF4中含有的KLF4编码序列与GenBank登录序列一致。2重组子pAd-KLF4和pAd的扩增和滴度测定经PacI酶切线性化的重组子pAd-KLF4和pAd在293A细胞内扩增后,所制备的重组病毒上清液中,病毒滴度为1×109 pfu/ml。3外源性KLF4在血管壁中的表达免疫组织化学染色显示,正常血管中KLF4表达量低,仅检测到痕量的KLF4。在pAd-KLF4转染组血管壁中,KLF4的表达量明显增加,阳性染色细胞数量及着色强度较pAd组明显增强,RT-PCR也证实,外源pAd-KLF4在血管组织中稳定表达。4过表达KLF4抑制球囊损伤诱导的血管内膜增生形态学分析显示:球囊损伤14天后,内膜/中膜(intima /media, I/M)厚度比达2.30±0.40,明显高于假手术组(0.12±0.03, p<0.05)。pAd转染组(为2.48±0.38)与损伤组相比无明显差异。而pAd-KLF4转染组血管内膜的增生程度(0.52±0.15)明显小于损伤组和pAd组(p<0.05)。表明KLF4过表达可以明显抑制球囊损伤诱导的血管内膜增生。5 KLF4过表达抑制球囊损伤诱导的增殖相关基因c-Jun和PCNA的表达免疫组化结果显示,正常血管内膜仅有c-Jun和PCNA少量表达。球囊损伤14天时,两种蛋白阳性染色的细胞及单细胞染色强度均较正常组显著增高。KLF4过表达可显著抑制c-Jun和PCNA表达。RT-PCR的结果证实外源性KLF4可以显著降低球囊损伤处血管组织的c-Jun和PCNA mRNA水平,与pAd组相比,分别降低了48.7%和59.2%,具有显著差异(p<0.01)。上述结果提示,KLF4过表达抑制球囊损伤诱导的血管内膜增生可能与其抑制增殖相关基因c-Jun和PCNA的表达有关。6 KLF4过表达可促进分化相关基因SM22α的表达免疫组织化学和RT-PCR结果显示:内皮剥脱后,pAd组SM22α表达较对照组明显下降,仅为对照组8 %。pAd-KLF4组SM22α的表达水平明显回升,为pAd组的3.7倍,提示外源性KLF4促进了分化相关基因SM22α的表达。结论:1.成功构建了pAd-KLF4腺病毒表达载体。2.成功建立颈总动脉腔内转染pAd-KLF4腺病毒载体的模型。3. KLF4过表达显著抑制内皮剥脱诱导的内膜增生。4.外源性KLF4抑制内膜增生的机制与下调增殖相关基因c-Jun、PCNA表达和上调分化相关基因SM22α表达有关。