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目的研究皮肤桥蛋白(DPT)和底板反应蛋白(SPON1)基因过表达后对肝癌细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响,探讨DPT、SPON1基因在肝癌发生发展过程中的作用,为肝癌侵袭转移提供新的生物学指标及基因治疗提供新的靶点。方法1、肝癌细胞株SK-Hep-1、HepG2及正常人肝细胞株L-02中DPT、SPON1基因及蛋白表达的检测:三种细胞培养,并抽提其总RNA,反转录成cDNA,采用qPCR检测DPT、SPON1基因的本底表达。提取三种细胞样本中的总蛋白,采用western blot检测其中DPT、SPON1蛋白的本底表达。2、含DPT、SPON1基因慢病毒质粒载体的包装及肝癌细胞的转染:将DPT、SPON基因慢病毒表达载体pLenti6.3-DPT-IRES-EGFP、pLenti6.3-SPON1-IRES-EGFP分别与包装质粒共转染293T细胞,进行目的基因过表达的慢病毒包装。确定包装成功后分别用含DPT、SPON1过表达慢病毒的293T细胞的培养液及慢病毒阴性对照病毒液Lenti-EGFP感染靶细胞SK-Hep-1、HepG2。实验设空白对照组、空质粒阴性对照组(NC组)和目的基因过表达组,qPCR检测转染细胞DPT、SPON1基因的表达,WB检测转染细胞DPT、SPON1蛋白的表达。3、转染肝癌细胞的增殖及迁移侵袭能力检测:CCK-8实验检测细胞的增殖情况,转染肝癌细胞在不同时间点(1D、2D、3D、4D、5D)用酶标仪读取450nm处的吸光值(OD值),根据OD值结果计算细胞的生长活力变化。Transwell实验检测细胞的迁移和侵袭能力,实验中细胞转入Transwell小室24小时后固定染色,用酶标仪读取OD值,比较细胞的迁移能力。细胞转入铺备基质胶的Transwell小室48小时后固定染色,用酶标仪读取OD值,比较细胞的侵袭能力。结果1、qPCR检测DPT、SPON1基因在肝癌细胞SK-Hep-1、HepG2及正常人肝细胞株L-02的表达:结果显示,DPT基因及蛋白在肝癌细胞SK-Hep-1、HepG2中表达均低于正常人肝细胞株L-02,在SK-Hep-1中最低,故选表达最低的肝癌细胞株SK-Hep-1作为研究DPT基因过表达对肝癌细胞增殖迁移能力的后续实验。SPON1基因及蛋白在肝癌细胞SK-Hep-1、HepG2中表达均低于正常人肝细胞株L-02,在HepG2中最低,故选取HepG2细胞作为SPON1基因过表达后续实验。2、慢病毒转染细胞的形态学观察:携带荧光标记的DPT、SPON1过表达慢病毒分别转染SK-Hep-1、HepG2细胞后48h,荧光显微镜下观察,可见绿色荧光信号明显,细胞生长状态良好,说明转染成功。3、转染细胞的表达:采用qPCR分别检测SK-Hep-1细胞DPT基因及HepG2细胞中SPON1基因的表达。结果表明:在SK-Hep-1细胞实验中,与空白组和NC组相比,实验组(过表达组,SK-Hep-1-DPT)细胞中的DPT基因表达显著上调(P<0.01);在HepG2细胞实验中,与空白组和NC组相比,实验组(过表达组,HepG2-SPON1)细胞中SPON1基因表达同样显著上调(P<0.01);说明两种过表达慢病毒包装成功。4、转染细胞的DPT、SPON1蛋白表达:慢病毒介导的目的基因转染靶细胞后提取总蛋白,WB检测发现,DPT蛋白在过表达组(SK-Hep-1-DPT)细胞中表达显著高于空白组和NC组(P<0.05);SPON1蛋白在过表达组(HepG2-SPON1)细胞中表达同样高于空白组和NC组(P<0.01)。进一步证明两种过表达慢病毒包装成功。5、CCK-8法检测转染肝癌细胞的增殖:CCK-8法分别检测三组细胞在不同时间点的增殖情况,结果显示,与空白组和NC组相比,过表达DPT组(SK-Hep-1-DPT)细胞的增殖活力显著受到抑制(P<0.05)。过表达SPON1组(HepG2-SPON1)细胞的增殖活力同样受到抑制(P<0.05)。说明过表达DPT和SPON1显著抑制肝癌细胞的增殖。6、Transwell实验检测转染肝癌细胞的迁移和侵袭:结果显示,与空白组和NC组对比,过表达DPT组(SK-Hep-1-DPT)细胞的迁移和侵袭能力受到显著抑制(P<0.05)。过表达SPON1组(HepG2-SPON1)细胞的迁移和侵袭能力也明显受到抑制(P<0.01)。说明过表达DPT和SPON1显著抑制肝癌细胞的转移。结论1、DPT基因及蛋白在SK-Hep-1细胞中本底表达最低,选取SK-Hep-1细胞作为DPT过表达及影响肝癌细胞增殖、迁移侵袭能力的后续实验;SPON1基因及蛋白在HepG2细胞中本底表达最低,选取HepG2细胞作为SPON1过表达及影响肝癌细胞增殖、迁移侵袭能力的后续实验。2、两种目的基因过表达慢病毒载体分别转染两种肝癌细胞株后,DPT、SPON1基因及蛋白表达显著上调,说明过表达慢病毒包装成功。3、CCK-8实验结果显示过表达DPT基因显著抑制SK-Hep-1细胞的增殖,过表达SPON1基因显著抑制HepG2细胞增殖。说明过表达DPT和SPON1显著抑制肝癌细胞的增殖。4、Transwell实验结果显示过表达DPT基因显著抑制SK-Hep-1细胞迁移侵袭能力,过表达SPON1基因显著抑制HepG2细胞迁移侵袭能力。说明过表达DPT和SPON1显著抑制肝癌细胞的转移。