钙网蛋白（Calreticulin，CRT）是定位于内质网中的保守蛋白，具有三个结构域N-domain，P-domain和C-domain。其中N-domain为凝集素结合序列，辅助新合成蛋白的正确折叠；P-domain和C-domain具有超强的结合Ca2+能力，可以维持细胞内Ca2+稳态，参与Ca2+介导的信号通路。　　随着CRT研究的不断深入，发现CRT可定位于内质网外。许多细胞表面都可以检测到CRT的表达，CRT通过与LDL受体相关蛋白（LRP）结合锚定在细胞表面，发挥其免疫相关的生物学功能。此外，CRT还可被分泌至细胞外，成为可溶性(soluble CRT,sCRT)。本实验室前期研究发现23.3%的RA和21.9%的SLE病人血清中可检测到sCRT，而健康人血清中sCRT均在检测限以下，这一结论也得到其他课题组的验证。自身免疫病患者血清中检测到CRT特异性抗体的报道也颇为常见，提示sCRT可能具有免疫原性。原核重组表达的CRT片段rCRT/39-272具有超强的免疫刺激活性，表现为在低剂量下可刺激小鼠腹腔巨噬细胞分泌细胞因子TNF-α、IL-6，并具有超强的免疫佐剂效应等。由此推论，血清sCRT浓度与RA等自身免疫性疾病密切相关，而且可能是一个提示自身免疫病病情严重程度的重要指标。　　真核表达体系比原核表达体系有更为完善的蛋白折叠及翻译后修饰，可以更好地呈现天然蛋白的功能。本课题通过构建CRT的真核表达载体，并表达纯化得到真核重组CRT（eukaryocyte CRT，eCRT），并将其与原核重组CRT（recombinant CRT，rCRT）对比发现rCRT主要以多聚体形式存在，eCRT仅以单体形式存在。与rCRT的超强免疫刺激活性相比，eCRT的激活作用则大为逊色。进一步分析理化性质与CRT功能的关系，发现脱糖基化的eCRT（tun-eCRT）与eCRT相比，刺激活性增强十倍左右，并且多聚体形式的原核重组rCRT（OrCRT）发挥主要的免疫刺激活性，而单体形式的原核重组rCRT（MrCRT）的免疫刺激活性与eCRT相仿。　　对rCRT激活巨噬细胞的机理进一步探索发现rCRT刺激巨噬细胞可促进巨噬细胞对rCRT的内吞并定位于溶酶体，受体阻断实验证明内吞作用依赖于清道夫受体A。基因水平研究发现MrCRT及OrCRT均可促进TNF-α及IL-6 mRNA的转录，但不影响mRNA的稳定性。TNF-α以及IL-6共同转录因子NF-κB的抑制剂可完全抑制CRT刺激的TNF-α及IL-6的转录，并且低剂量的OrCRT可有效促进IkBa的降解及NF-kB的磷酸化，MrCRT的刺激作用相之较弱。OrCRT可持续激活MAPK家族三个激酶的磷酸化，但抑制剂阻断实验证明CRT刺激巨噬细胞释放TNF-α依赖于JNK的激活，释放IL-6是JNK、ERK共同介导的。此外，OrCRT和MrCRT均可抑制Ca2+-ATP酶的活性，使胞内钙离子浓度升高，从而诱导UPR的效应分子GRP78/Bip水平升高，启动下游信号通路的激活，进而激活JNK以及NF-kB，增强靶基因TNF-α、IL-6的转录。　　综上所述，本文通过比较eCRT及rCRT的理化性质及其免疫生物学活性，阐明了多聚化以及脱糖基化可增强CRT的免疫刺激活性。CRT激活巨噬细胞的机制主要是通过激活JNK及ERK的激酶活性，增强NF-κB对下游TNF-a、IL-6 mRNA的转录，最终促进炎性细胞因子的释放。