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本研究在课题组利用iTRAQ技术分别构建大粒马齿型玉米自交系丹232和小粒爆裂玉米自交系N04不同发育时期果皮和胚乳差异表达蛋白库的基础上,挑选功能预测为外切葡聚糖酶转氨酶的差异表达蛋白,克隆了两个自交系外切葡聚糖酶转氨酶基因ZmEXGA的全长cDNA序列及其DNA序列,并进行了功能预测、不同发育时期果皮和胚乳表达分析,以及亚细胞定位。同时构建了该基因的超表达载体,并转拟南芥筛选出T1代阳性植株,为进一步深入研究该基因在玉米籽粒发育过程中的功能奠定了基础。 主要研究结果如下: 1.从iTRAQ蛋白库中选取玉米自交系N04授粉后20 d果皮表达量较自交系丹232高3倍、初步预测功能为外切葡聚糖酶转氨酶的一条肽段,利用电子延伸和RT-PCR方法成功克隆了两个玉米自交系外切葡聚糖酶转氨酶基因ZmEXGA的全长cDNA和DNA序列。两个自交系该基因的全长cDNA序列为2138 bp,编码区为1866 bp,编码622个氨基酸,5’非编码区为23 bp,3’非编码区为250 bp。两个自交系ZmEXGA基因的DNA序列为5529 bp和5622 bp。两个自交系间ORF存在11个碱基差异,其中1个碱基差异引起编码氨基酸由丙氨酸变为苏氨酸。两个自交系间DNA序列在启动子区域存在较大差异,自交系N04相比丹232含有6个长短不一的缺失片段及16个SNP差异。生物信息学预测显示,该基因编码的蛋白结构域属于糖苷水解酶第三家族GH3,同时对其编码蛋白的理化性质及二级、三级结构进行了分析。 2.系统进化分析发现,ZmEXGA基因编码的蛋白质与谷子具有较高的同源性(93%),与拟南芥的同源性为77%。通过ZmEXGA基因编码序列(CDS)序列与B73(B73 RefGen)比对,推测该基因为单拷贝,可能位于玉米第1染色体上。 3.采用荧光定量PCR方法对ZmEXGA基因在两个自交系丹232和N04不同籽粒发育时期(10DAP、20DAP、33DAP和46DAP)果皮和胚乳中的表达分析结果表明,该基因在果皮中表达量均高于胚乳,且以丹232的10DAP果皮表达量最高,与该基因的蛋白表达结果比较,除自交系N04果皮外,其趋势基本一致。 4.利用ZmEXGA基因和经过改造添加了GFP元件的表达载体P-Super1300构造融合表达载体,通过农杆菌介导方法转入洋葱表皮瞬时表达进行亚细胞定位分析结果显示,该基因主要在细胞膜或细胞膜壁上表达。该结果与利用PSORT II预测结果相一致。 5.选用超表达载体pCAMBIA1304构建ZmEXGA基因的超表达载体pCAMBIA1304-ZmEXGA,通过农杆菌介导方法转入拟南芥,筛选得到T1代阳性植株。