【摘 要】
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产毒素多杀性巴氏杆菌可以分泌由toxA基因编码的多杀性巴氏杆菌毒素（Pasteurella multocida toxin,PMT）,引起猪进行性萎缩性鼻炎（Progressive atrophic rhinitis,PAR）。本研究在产毒素多杀性巴氏杆菌鉴定以及强毒株筛选基础上,对toxA分段克隆表达,并用重组蛋白进行小鼠免疫保护试验测定其保护效果,为产毒素多杀性巴氏杆菌PMT保护性抗原片段的筛
【基金项目】
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校企合作横向项目,新型猪萎缩性鼻炎亚单位疫苗的研究与开发（ZM20200526）；
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产毒素多杀性巴氏杆菌可以分泌由toxA基因编码的多杀性巴氏杆菌毒素（Pasteurella multocida toxin,PMT）,引起猪进行性萎缩性鼻炎（Progressive atrophic rhinitis,PAR）。本研究在产毒素多杀性巴氏杆菌鉴定以及强毒株筛选基础上,对toxA分段克隆表达,并用重组蛋白进行小鼠免疫保护试验测定其保护效果,为产毒素多杀性巴氏杆菌PMT保护性抗原片段的筛选以及亚单位疫苗的研制奠定基础。主要研究内容如下:1.产毒素多杀性巴氏杆菌的鉴定及毒力测定从实验室保存的10株疑似菌株中最终鉴定出8株产毒素多杀性巴氏杆菌:8株细菌的培养特性和菌体形态均符合多杀性巴氏杆菌的特征;使用多杀性巴氏杆菌通用引物进行PCR鉴定均呈阳性;使用型特异性引物进行PCR鉴定均为D型;使用toxA基因引物进行PCR鉴定表明其均携带PMT毒素基因。毒力测定结果显示,8株产毒素多杀性巴氏杆菌经腹腔途径接种KM小鼠的毒力差异较大,TPM-7株的毒力最强,其LD50为29 CFU;TPM-9株的毒力最弱,其LD50为5.50×10~5CFU;其他6株的毒力介于7.00×10~2～3.63×10~4 CFU之间,且在不同数量级均有分布:TPM-6为7.00×10~2 CFU,TPM-2为3.72×10~3CFU,TPM-1、TPM-3和TPM-5均位于10~4CFU数量级。2.产毒素多杀性巴氏杆菌toxA基因的分段克隆及表达为筛选表达量高且免疫原性强的PMT抗原片段,本研究根据该菌PMT的结构和功能区将其设计为7个子片段（N端2个,C端5个）和1个全长片段,采用PCR技术从产毒素多杀性巴氏杆菌TPM-6菌株中扩增出PMT的8个抗原基因片段,利用原核表达系统克隆并表达后采用SDS-PAGE和Western blot检测表达及纯化情况。结果显示,获得8个重组蛋白,分别命名为rPMT-N1～rPMT-N2、rPMT-C3～rPMT-C7和全长蛋白rPMT。其表达量占菌体总蛋白的6.29%～33.74%,其中全长蛋白rPMT以可溶性形式表达,rPMT-C5以可溶性和包涵体两种形式表达,其他6个重组蛋白均以包涵体形式表达。纯化后,8个重组蛋白的纯度介于34.13%～94.67%,浓度为0.41 mg/m L～2.99 mg/m L。Western blot结果显示,8个重组蛋白均显示出一定的反应原性,其中rPMT-C6、rPMT-N1的反应原性最强,其次是rPMT-C4、rPMT-N2、rPMT-C3、rPMT-C7和rPMT-C5,rPMT的反应原性最弱。蛋白的稳定性试验结果表明,rPMT-C3、rPMT-C4和rPMT-C6在室温、4℃和-20℃条件下保存30 d后,稳定性良好,蛋白无明显降解;rPMT-C7有一定降解;rPMT-N1和rPMT-N2稳定性较差。本研究为PMT保护性抗原片段的筛选及亚单位疫苗的研发奠定基础。3.产毒素多杀性巴氏杆菌毒素toxA抗原片段免疫原性鉴定使用商品化试剂盒,纯化获得了PMT毒素C端的四个重组蛋白rPMT-C3、rPMT-C4、rPMT-C6和rPMT-C7,分别制备其ISA201佐剂疫苗（250μg/m L）,并两次皮下免疫小鼠（0.2 m L/只/次）。使用PMT毒素对小鼠进行腹腔攻毒,结果显示,低毒素剂量攻毒时(3 LD100),所有蛋白保护效果为100%。15 LD100攻毒时,rPMT-C4保护率为75%,其余蛋白保护效果为100%。30 LD100攻毒时,rPMT-C3和rPMT-C4保护率为25%,rPMT-C6和rPMT-C7的保护效果为100%。56 LD100攻毒时,rPMT-C3、rPMT-C4、rPMT-C6和rPMT-C7对小鼠保护效果分别为0%、25%、100%和75%。未经变性和变性的rPMT-C7包涵体蛋白进行小鼠免疫保护对比试验,结果显示未经变性的rPMT-C7对小鼠无任何保护效果,而变性的rPMT-C7蛋白具有良好保护效力。本试验所用重组蛋白苗对小鼠均具有一定的免疫保护力,其中rPMT-C6和rPMT-C7能提供免疫小鼠完全保护,但前者较后者的稳定性更好,因此rPMT-C6更具潜力用于产毒素多杀性巴氏杆菌亚单位疫苗的研发。
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