革兰阳性球菌是引起人类感染性疾病的重要病原。在过去的10多年里，革兰阳性球菌感染所占比例逐渐增加，目前凝固酶阴性葡萄球菌、金葡菌以及肠球菌已上升至医院获得血流感染病原的前三位，同时革兰阳性球菌对临床常用抗菌药物耐药性日益严重，其中耐甲氧西林葡萄球菌、耐万古霉素肠球菌以及青霉素不敏感肺炎链球菌在临床上分离率高，所致感染治疗困难，是当前最受关注的耐药革兰阳性球菌。由于耐药菌所致感染的病死率高于敏感菌，可选用的药物种类有限，而有效治疗的延误可导致病死率升高，故早期、准确的病原学诊断有助于提高感染性疾病的治疗水平，并可减少抗菌药物的滥用，进而减少不良反应的发生，延缓耐药性的发生与蔓延，并可减少医疗费用。由于常规病原学诊断方法包括标本中细菌培养、分离以及药敏，所需时间长(3～5天)，难以及时指导感染性疾病的治疗。而随着分子生物学与细菌基因组学的发展，快速、灵敏的核酸检测方法已用于耐药菌的检测，且逐渐被人们所接受。本课题在分析临床常见病原菌共有的23S rRNA基因以及革兰阳性球菌主要耐药基因的基础上，建立了可用于检测耐药革兰阳性球菌的快速基因诊断方法，有望为临床重症感染的早期病原诊断和及时正确的抗感染提供客观依据。 第一部分 临床常见病原菌分子生物学鉴定方法研究 核糖体核糖核酸(ribosomal RNA,rRNA)基因为所有生物体生存所必需的基因序列并且也是较保守的序列。细菌的rRNA基因由5S、16S以及23S rRNA基因三部分构成。其中基因序列均含有保守区和多变区，多变区序列在不同种类细菌中各不相同，可提供区分不同细菌的重要信息，故多变区的序列可用于细菌的进一步区分和鉴定；利用基因序列保守区可设计通用引物，使同时扩增、检测多种细菌成为可能，以往应用16S rRNA基因检测细菌较多，近年来23S rRNA基因的应用有所增多。故本研究为明确23S rRNA基因用于临床常见致病菌鉴定的可行性，首先利用多变区两端保守序列设计的一对通用引物，对13种临床常见致病菌的23S rRNA基因部分序列进行了扩增及测序，序列采用DNAStar软件进行分析，结果显示13种临床常见致病菌的23S rRNA基因序列存在较多差异；在此基础上根据革兰阳性球菌与革兰阴性菌的序列差异设计了一条针对革兰阳性球菌的引物，联合原有通用引物扩增，建立了PCR-凝胶电泳检测法用于革兰阳性球菌与革兰阴性菌的鉴别，其中革兰阳性球菌经扩增可出现两条电泳条带，而革兰阴性菌仍只出现一条电泳条带，通过该方法不但可检测临床常见致病菌，而且可明确被测细菌为革兰阳性球菌抑或革兰阴性菌;随后根据不同菌株在该基因片段的特异序列，分别设计了相应探针，并在通用引物上标记地高辛，建立了PCR一反向杂交检测方法，该方法可将临床常见的致病菌鉴定到种，以上两种方法在临床分离株中进行了验证，具有良好的灵敏度、特异性以及可重复性。研究结果显示，235 rRNA基因可用于临床常见致病菌，如:金葡菌、凝固酶阴性葡萄球菌、肠球菌、肺炎链球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌以及肺炎克雷伯菌等的检测与鉴定。第二部分耐药革兰阳性球菌主要耐药基因检测方法研究 耐甲氧西林葡萄球菌(methieillin一resistant staPhylocoeei，MRS)、耐万古霉素肠球菌(vancomyein一resistant enieroeoeei，v既)以及青霉素不敏感肺炎链球菌(penieillin nonsuseeptible steptoeoeeus pneumoniae，pNSSp)是目前临床上最重要的耐药革兰阳性球菌，建立快速、特异、灵敏的检测方法对这类细菌所致感染的诊治具有重要意义。这些耐药菌的耐药机制己基本明确，由于mecA、va叭与vanB分别是MRS与VRE的耐药决定基因，上述基因的检出可以确定被测细菌为相应的耐药菌，故我们首先分析了meeA与vanA、vanB的基因序列，分别设计了mecA基因的特异性引物和va几A、vanB两种基因的通用引物，建立了可扩增mecA与vanA/B的PCR检测方法;PNSSP的耐药机制与上述2类耐药有所不同，是由于编码PBPs的基因，其中主要是PBPZb基因发生变异，它们的编码产物与青霉素的亲和力下降，从而导致肺炎链球菌对青霉素耐药。国内该方面研究较少，为明确国内PNSSP株PBPZb序列的变异区域，以便给后续PNSSP感染病原基因诊断方法的建立提供依据，我们对42株青霉素MIC在0.006一32mg几的肺炎链球菌临床分离株的PBPZb基因片段进行了限制性长度片段多态性分析(restriction fragment length polymo印hism，盯LP)，并对其中具有代表性的4株PNSSP以及1株PSSP临床分离株的PBPZb基因作了进一步的测序分析。结果显示PSSP分离株(编号02一12一犯6)的PBBZb基因序列与先前报道青霉素敏感株序列(登录号:X16022)相比，仅有3个核昔酸的改变，且无氨基酸序列变化。PNSSP临床分离株均有多变区域(1500一1540bp位置以X16022序列为参考)序列的改变，故重新设计新引物，建立了相应的PCR扩增方法。以上三种PCR扩增方法经临床分离株、标准株以及其他非细菌基因组验证，显示了良好的灵敏度、特异性及可重复性，但三者中，mecA基因的检出可判断被测细菌为MRS;夕 va川叼B基因的检出只能提示被检测细菌为VR