【摘 要】
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伪狂犬病(Pseudorabies,PR)又称Aujeszky氏病,是由疱疹病毒科(Herpesviridae)α疱疹病毒亚科(Alpha-herpesririnae)引起的多种动物的一种以发热、奇痒(猪除外)、繁殖障碍、神
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伪狂犬病(Pseudorabies,PR)又称Aujeszky氏病,是由疱疹病毒科(Herpesviridae)α疱疹病毒亚科(Alpha-herpesririnae)引起的多种动物的一种以发热、奇痒(猪除外)、繁殖障碍、神经症状(脑脊髓炎)为主要临床症状的高度致死性、急性传染病。世界动物卫生组织(OIE)将其归为二类动物传染病,是典型的极难防疫的自然异源性疾病,给全球畜牧业造成了极大的经济损失。猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)是猪伪狂犬病的病原,其基因组为双股线性DNA,全长为150kb左右,有70-100种编码蛋白质,成熟的病毒粒子约含有50种蛋白质。长期以来,研究疱疹病毒基因功能的主要方法是通过构建基因缺失突变株来实现的,但传统的同源重组使构建工作非常繁琐,得到的突变株遗传稳定性差,使疱疹病毒的研究受到了限制。自从1999年,美国学者Gregoory等[1]成功构建了伪狂犬病毒的全长感染性克隆以来,对疱疹病毒基因结构和功能的研究起到了巨大的推动作用,并为疱疹病毒作为高效载体系统的开发提供了崭新的途径。本研究根据PRV Fa株的部分TK基因以及两侧的UL22、UL24基因扩增含有两个Loxp位点的左、右同源臂,将获得的左、右同源臂Fa TKA和Fa TKB替换本实验室已经构建好的转移载体p UC-TKA2-GFP-gpt-TKB(PRV流行毒株)中的TKA2和TKB,获得PRV Fa株的中间转移载体p UC-Fa TKAM-GFP-gpt-Fa TKB,然后将p Belo BAC11载体线性化后插入到p UC-Fa TKAM-GFP-gpt-Fa TKB中构建了重组病毒转移载体p UC-Fa TKAM-GFP-gpt-Fa TKB-BAC。将PRV Fa基因组DNA与重组病毒转移载体共转染Vero细胞,经过3轮gpt加压筛选和4轮噬斑筛选得到了纯化的带BAC质粒的重组伪狂犬病毒r PRV-Fa-BAC。将纯化的重组病毒r PRV-Fa-BAC感染Vero细胞,适时提取环状的重组病毒基因组DNA,电转化DH10B感受态细胞,通过Bam HⅠ酶切鉴定筛选BAC分子化克隆,将阳性BAC克隆转染Vero细胞得到拯救的重组病毒v PRV-BAC-Fa。重组病毒v PRV-BAC-Fa在Vero细胞上盲传4代后,gpt加压筛选标记基因和GFP绿色荧光基因仍然存在,通过PCR检测插入的其它外源片段对以及PRV中的关键基因,并选择部分基因进行序列测定,结果表明拯救的重组伪狂犬病毒v PRV-BAC-Fa得到了稳定的遗传。通过对亲本毒PRV Fa P8、纯化的重组病毒r PRV-Fa-BAC和拯救的重组病毒v PRV-BAC-Fa的体外生长特性研究,结果发现v PRV-BAC-Fa在PK-15细胞上的增殖速度比亲本毒约慢4 h,说明TK基因缺失可以使病毒在细胞上的增殖速度减慢。PRV Fa株细菌人工染色体感染性克隆的成功构建,为获得无毒力但免疫原性良好的PRV基因缺失疫苗候选株奠定基础,对PRV反向遗传操作技术平台的建立具有重大而深远的意义。
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