红藤四萜大环内酯酸钠对肝癌的药效学及作用机制研究

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肝癌是严重威胁人类健康的恶性肿瘤之一,90%以上是肝细胞性肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)。近几十年来,我国HCC的治疗尽管取得了长足的进步,手术切除率、术后生存率及生存质量均有较大提高,但与其他肿瘤相比,HCC的疗效远未如人意。肝癌的发生发展是一个多步骤、多基因参与的复杂过程,其具体的发病机制仍不是十分清楚,肝癌临床生物学行为较恶、预后极差,其早期肝内转移以及术后早期复发的特性直接影响治疗方法的选择及患者的生存质量和生存时间。近年来,伴随着纳米分子医学、分子生物学技术突飞猛进的发展、肿瘤发生机制的阐明及新的肿瘤治疗靶点的发现等,新型抗肿瘤药物的开发以及治疗手段的创新和综合运用都取得了令人可喜的成果。在众多抗肿瘤药中,植物单体类抗肿瘤药所占的比重仍然较大,植物单体类抗肿瘤药物紫杉醇和多西他赛足以说明植物单体类抗肿瘤药物在目前肿瘤治疗中的重要作用。目的:随着放、化疗药物的毒副作用等问题愈显突出,新型高效低毒抗肿瘤药物的研发日益受到人们的关注。目前,大环内酯类药物在非感染性疾病中的作用研究日趋活跃。红藤四萜大环内酯酸钠是利用声膜分离技术从天然植物大血藤中提取的单体物质,经成盐反应得到红藤四萜大环内酯酸纳(Sargentgloryvine stem polyterpene macrolide acid sodium,SPMA),其分子式为C38H46O8Na。前期预实验结果表明该药物对多种恶性肿瘤细胞具有明显的抑制增殖和诱导凋亡作用。因此,我们拟通过对红藤四萜大环内酯酸钠的体内外药效学及一般毒理学研究,明确其抗肿瘤作用及机制,为其进一步的临床前研究奠定理论基础,也为获得一种新型的高效低毒的具有自主知识产权的抗肿瘤药物奠定实验基础。方法:(1)应用不同浓度的红藤四萜大环内酯酸钠作用于肝癌细胞HepG-2和HHCC,通过对细胞生长曲线测定、细胞周期检测、凋亡检测以及荷瘤裸鼠抑瘤试验等,明确红藤四萜大环内酯酸钠的药效学。(2)应用高通量基因表达谱芯片检测药物作用前后基因差异表达情况,通过对差异表达基因所在通路的分析,筛选出红藤四萜大环内酯酸钠诱导肝癌细胞凋亡进而发挥抑制肝癌细胞生长的主要通路,为进一步阐明其作用机制奠定实验基础。(3)针对上述筛选出的通路,通过基因转染、基因干涉等技术进行各种分子生物学、细胞生物学实验,证实红藤四萜大环内酯酸钠通过该通路诱导肿瘤细胞凋亡,明确其抗肿瘤作用的靶点。(4)通过对单次给药前后的SD大鼠血压和心率的监测、连续给药一个月的SD大鼠的血常规和血清各项生化指标的检测以及连续给药大鼠主要脏器的组织切片HE染色观察,明确红藤四萜大环内酯酸钠在有效抑瘤作用的剂量下是否对机体主要脏器功能造成影响,是否会产生明显的全身毒副作用。结果:(1)红藤四萜大环内酯酸钠能显著影响肝癌细胞的生长状态、抑制肝癌细胞的增殖,且具有一定的时间和剂量依赖性,但对正常人单个核细胞PBMCs未见明显生长抑制作用。此外,红藤四萜大环内酯酸钠能阻滞细胞周期于S期,并诱导肝癌细胞HepG-2及HHCC凋亡。体内荷瘤动物实验显示红藤四萜大环内酯酸钠能显著缩小荷瘤鼠的移植瘤体积,并且主要器官的组织切片HE染色未见明显的病理学变化。(2)通过基因表达谱分析,药物作用肝癌细胞HepG-2后,差异表达基因共计有4349个,通过对显著差异表达基因相关通路的Pathway分析,筛选出了两条红藤四萜大环内酯酸钠抑制肝癌细胞增殖并诱导细胞凋亡的通路:一条为内源性线粒体途径:bcl-2—线粒体—Ceyt C—caspase 9凋亡通路;另一条为Skp2介导的细胞周期阻滞诱导的凋亡途径。(3)红藤四萜大环内酯酸钠可下调bcl-xl和mcl-1基因表达,上调bak基因的表达并引起胞浆内细胞色素C蛋白的聚积。(4)通过Skp2干涉载体转染细胞,下调细胞内Skp2表达后,药物对细胞的增殖抑制作用明显降低,细胞未出现明显的凋亡现象。(5)连续给药一个月(每3天一次)后,受试SD大鼠的血常规及各项主要生化指标均在其参考区间范围内,各主要脏器的组织切片HE染色也未见明显的病理学变化。结论:(1)体内外药效学实验证实,红藤四萜大环内酯酸钠能显著抑制肝癌细胞的增殖并诱导细胞凋亡,且在有效治疗剂量范围内未见对机体产生明显的毒副作用。(2)红藤四萜大环内酯酸钠能通过下调bcl-2家族中的抑凋亡基因bcl-xl和mcl-1的表达并上调该家族促凋亡基因bak的表达,进而激活内源性线粒体凋亡通路,引起细胞色素C的释放,进一步激活caspase 9而引起肝癌细胞凋亡。(3)红藤四萜大环内酯酸钠可同时以S期激酶相关蛋白Skp2为靶点,引起细胞阻滞于S期,促进细胞凋亡。(4)治疗剂量的红藤四萜大环内酯酸钠对机体造血功能、肝及肾功能未产生明显影响,未见明显的全身毒副作用。综上所述,红藤四萜大环内酯酸钠有望成为一种新型的、高效低毒的、安全有效的抑制肝癌细胞增殖、诱导凋亡的新型抗肝癌中药单体药物。
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