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目的:人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)是疱疹病毒β亚科的双链DNA病毒,人群感染率高达60%-90%,主要表现为无症状潜伏感染,但在新生儿及免疫缺陷患者中是重要的病原体,可从潜伏感染状态激活,引起新生儿迟发性神经系统功能障碍如感音神经性耳聋和神经系统发育障碍,或者引起视网膜炎、肺炎、脑病、多发性神经根病等。HCMV的潜伏感染及其激活机制尚未完全明确,关于病毒编码的lncRNAs与HCMV潜伏感染之间的关系更是罕见报道。LncRNAs是一类长度>200nt且不表现任何蛋白质编码潜能的非编码RNAs,参与到细胞凋亡调控、肿瘤发生发展、感染等各个生理病理过程中。HCMV编码的lncRNA4.9可能通过抑制其下游调控因子NAB2来促进转录因子EGR1的表达,使得EGR1与IE2的结合增加,游离IE2减少,从而抑制病毒增殖,促进HCMV进入潜伏感染状态。本研究旨在明确HCMV编码的lncRNA4.9对HCMV潜伏感染的影响,并揭示其机制,从而加深对HCMV潜伏感染机制的理解,并为HCMV感染的临床防治提供新的思路。方法:1.构建和筛选lncRNA4.9以及验证NAB2的有效干扰慢病毒载体:设计并合成得到 4 种 shRNA(NAB2-shRNA、lncRNA4.9-shRNA-1、lncRNA4.9-shRNA-2、lncRNA4.9-shRNA-3)。将酶切后的线性化载体与扩增纯化后的目的基因进行连接,并转化感受态细胞。对阳性克隆进行测序鉴定,比对准确的可进行病毒扩增以及包装、滴度测定,得到4种慢病毒干扰载体(LV-NAB2-RNAi、LV-lncRNA4.9-RNAi-1、LV-lncRNA4.9-RNAi-2 和 LV-lncRNA4.9-RNAi-3),将其分别转染入HCMV感染的THP-1细胞中,通过real-time RT-PCR法及Western-Blot法分别检测干扰效果。2.建立有效稳定的HCMV潜伏感染模型:HCMV towne株分别感染THP-1(潜伏组)和MRC-5(增殖组)细胞,并观察细胞形态变化,收集细胞以提取RNA以及蛋白样品,通过real-time RT-PCR法检测相关基因UL122、UL138 mRNA表达量以及lncRNA4.9的表达量,通过Western-Blot法检测IE1/IE2、UL138蛋白表达量,通过荧光定量PCR法检测细胞内病毒拷贝数的变化情况。3.lncRNA4.9以及其下游关键因子NAB2的表达水平对HCMV潜伏感染的影响:实验分为2部分,其一是用lncRNA4.9干扰慢病毒载体转染HCMV潜伏感染的THP-1细胞以调控lncRNA4.9的表达,通过real-time RT-PCR法及Western-Blot法检测对照组与干扰组细胞内HCMV拷贝数、增殖相关基因IE1/IE2的蛋白表达水平,以及下游调控因子NAB2的mRNA及蛋白水平;其二是将NAB2干扰慢病毒载体转染入HCMV潜伏感染的THP-1细胞以调控NAB2的表达水平,通过real-time RT-PCR法及Western-Blot法检测对照组与干扰组细胞内HCMV拷贝数、增殖相关基因IE2的蛋白表达水平,以及下游调控因子EGR1的表达水平,同时通过细胞免疫荧光实验初步验证EGR1与IE2的的结合情况。结果:1.成功构建并筛选lncRNA4.9以及NAB2的有效干扰慢病毒载体:通过双脱氧链终止法测定克隆载体序列,结果显示与预期一致,可进一步扩增慢病毒并进行包装、纯化,检测病毒拷贝数,显示慢病毒扩增成功,可用于慢病毒干扰载体筛选及验证实验,real-time RT-PCR及Western-Blot结果显示与对照组相比,LV-NAB2-RNAi 组能显著下调 NAB2 的表达,LV-lncRNA4.9-RNAi-2 和LV-lncRNA4.9-RNAi-3能显著下调lncRNA4.9的表达水平,挑选干扰效果更显著的LV-lncRNA4.9-RNAi-2组慢病毒进行后续实验。2.HCMV在感染THP-1细胞后第5天进入潜伏感染状态:THP-1细胞在感染HCMV后逐渐聚团生长、变大膨胀。感染后第5天HCMV细胞内拷贝数显著下降,同时增殖相关基因UL122的mRNA和蛋白水平在第5天开始下降,至第7天基本不表达。UL138的mRNA和蛋白以及lncRNA4.9一直持续表达。而MRC-5细胞感染HCMV后,细胞逐渐膨胀,至第5天细胞基本全部病变并且数量减少,HCMV拷贝数持续上升,至第5天与地3天持平,UL122 mRNA和lncRNA4.9表达量呈持续上升趋势,IE2蛋白和UL138蛋白持续高表达。3.(1)干扰组细胞内HCMV拷贝数在干扰lncRNA4.9后第7天时较对照组增加;NAB2mRNA表达量在两组间无明显差异,蛋白表达量在第7天时较对照组增加;IE1/IE2蛋白表达量第3天时在两组间无明显差异,第7天时对照组IE2蛋白不表达,干扰组IE2蛋白仍表达。(2)干扰NAB2后第3、7天与对照组相比,干扰组细胞内病毒拷贝数明显下降;EGR1 mRNA水平增加,EGR1蛋白表达量只在第7天时增加;干扰组与对照组IE2蛋白在感染后第3天均有表达,干扰组略高于对照组,第7天时基本不表达,细胞免疫荧光结果初步显示部分EGR1与IE2结合。结论:1.本实验成功构建并筛选出有效的lncRNA4.9和NAB2干扰载体2.本实验揭示了 lncRNA4.9作为潜伏感染相关因子,在潜伏感染后期下调lncRNA4.9可以显著上调IE2和HCMV拷贝数水平,可能激活HCMV增殖感染。3.本研究进一步明确了 lncRNA4.9对NAB2的调控作用以及NAB2通过EGR1对IE2的募集作用,干扰NAB2在HCMV感染前期可以显著下调HCMV拷贝数,可能参与促进HCMV的潜伏感染。