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研究目的:活性氧（ROS）诱导的氧化应激损伤是心脏缺血-再灌注损伤的重要发病机制。7,8-二羟基黄酮（7,8-dihydroxyflavone,DHF）是黄酮家族一员,是新发现的酪氨酸激酶B受体（TrkB）的特异性激动剂,具有强大的神经保护和营养作用。此外,DHF在不同细胞的氧化应激损伤模型中都发挥抗氧化与抗凋亡作用。本实验利用过氧化氢（H2O2）诱导的H9c2心肌细胞损伤模型,观察了DHF的保护作用并探讨其作用机制,为DHF进一步用于心脏缺血-再灌注损伤的治疗提供实验依据。研究内容和方法:1.DHF预处理1 h再加入H2O2孵育24 h,通过MTT法和检测培养液乳酸脱氢酶（LDH）水平,观察DHF的保护作用。2.通过检测细胞内活性氧（ROS）和p-H2A.X蛋白水平,观察DHF的抗氧化作用。3.利用流式细胞术检测DHF对线粒体膜电位的影响。4.利用Western blot法检测DHF对Bcl-2、Bax、cytochrome c和cleaved caspase 3蛋白表达的影响。5.通过检测底物吸光度观察DHF对细胞内caspase 8和caspase 9活性的影响。6.利用Western blot法检测DHF对ERK、Akt通路的影响,利用MTT法观察两种通路抑制剂对DHF保护作用的影响。7.利用MTT法观察特异性TrkB受体阻断剂ANA-12对DHF保护作用的影响。8.利用Western blot法检测ANA-12对ERK、Akt通路的影响。研究结果:1.不同浓度H2O2处理24 h剂量依赖性诱导H9c2心肌细胞损伤,其中700μmol/LH2O2使细胞存活率下降至（0.55±0.01）（P<0.01）。DHF（5-20μmol/L）预处理1 h对H2O2（700μmol/L,24 h）损伤的心肌细胞具有明显的保护作用,其中DHF（10μmol/L）使细胞存活率升至（0.81±0.02）（P<0.01）,其保护作用最为显著。后续实验中,DHF和H2O2浓度分别选用10μmol/L和700μmol/L。2.与对照组相比,H2O2处理细胞24 h后,培养液内乳酸脱氢酶（LDH）含量增加了2.02倍（P<0.01）,DHF预处理明显减少了LDH释放（P<0.05）。3.与对照组相比,H2O2组细胞内ROS产量增加1.34倍（P<0.01）,p-H2A.X蛋白水平升高2.44倍（P<0.01）,DHF预处理可显著抑制ROS水平（P<0.01）和p-H2A.X蛋白表达（P<0.05）。4.与对照组相比,H2O2处理细胞24 h后,线粒体膜电位（MMP）下降了（14.15±2.79）%（P<0.01）,DHF预处理几乎完全拮抗了MMP的异常变化（P<0.01）。5.与对照组相比,H2O2组Bcl-2/Bax比值降低（P<0.05）,线粒体内cytochrome c含量减少（P<0.01）,cleaved caspase 3蛋白水平升高3.92倍（P<0.01）,提示H2O2诱导了线粒体途径的凋亡,DHF预处理抑制了上述各种异常变化。6.与对照组相比,H2O2处理后caspase 8和caspase 9活性分别增加1.8倍和1.33倍（P<0.01）,而DHF预处理可以有效抑制这两种凋亡酶的激活（P<0.01）。7.Western blot结果显示:H2O2可以显著降低p-ERK1/2（P<0.05）和p-Akt（P<0.01）蛋白表达,DHF预处理则增加其磷酸化水平（P<0.05）,此作用可被MEK1/2抑制剂PD98059和PI3K抑制剂LY294002部分阻断（P<0.05）。MTT结果显示:上述两种通路抑制剂可以部分阻断DHF的保护作用（P<0.01）。8.MTT结果显示:TrkB拮抗剂ANA-12（5μmol/L）预处理30 min后,DHF的保护作用部分被阻断（P<0.01）。9.Western blot结果显示:ANA-12（5μmol/L）预处理后能显著降低由DHF引起的p-ERK1/2和p-Akt蛋白表达的升高（P<0.05）。结论:综上所述:7,8-二羟黄酮（DHF）对H2O2诱导的H9c2心肌细胞损伤具有明显的保护作用,该作用和DHF强大的抗氧化能力、抗线粒体途径凋亡以及通过结合TrkB受体激活下游的ERK和Akt信号通路密切相关。