梅PmSLY1基因的克隆、表达分析及其与DELLA蛋白的互作研究

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梅(Prunus mume Sieb.et Zucc.)属蔷薇科(Rosaceae)李属(Prunus L.),起源于我国东南部,是重要的一种经济型果树。其花观赏价值较高,果实则含有多种利于人体代谢的氨基酸,其果实主要用于加工。果梅相比于其它落叶果树,开花萌芽比较早,由于其需冷量范围较大,因此是研究木本果树季节性休眠机制的一种好材料。DELLA蛋白在GA信号转导途径中是抑制因子,能够抑制植物的生长发育。为了研究F-box蛋白的编码基因SLY1在果梅季节性休眠中对DELLA蛋白的作用,本文以国家果梅种植资源圃中的果梅品种‘桃形梅’为试验材料,克隆得到了PmSLY1基因,并且利用生物信息学对其序列结构和功能做进一步的分析;对转PmRGL2基因杨树进行休眠处理,观察其表型;利用qRT-PCR技术分析PmRGL2基因及与GA4信号转导相关的部分基因在转基因杨树中的表达水平;同时分析PmSL Y1基因在果梅不同休眠时期的表达量。进一步构建了酵母双杂表达载体,利用酵母双杂交系统验证PmSLY1和PmRGL2蛋白之间是否存在互作。主要结果如下:1.根据NCBI比对已知梅基因组序列mRNA,从果梅品种‘桃形梅’花芽中克隆了SLY1基因,其完整编码区序列为1866bp,编码621个氨基酸。经NCBI比对发现,该序列具有Sec1域,我们将该基因命名为PmSLY1。利用生物信息学技术分析PmSLY1蛋白的基本理化性质。结果发现:PmSLY1蛋白主要由α-螺旋、延伸链、与无规卷曲构成,是疏水性蛋白质,且不具跨膜结构;同源序列比较表明,PmSLY1与桃(Prunus Persica)的SEC1家族转运蛋白SLY1具有很高的同源性。2.以转PmRGL2基因杨树为试材,提取转基因组培苗叶片中的RNA,并对PmRGL2和GA信号通道相关基因GID1b、GA20ox2和GA3ox1进行qRT-PCR分析,结果表明,与野生型杨树相比,转基因株系中的PmRGL2、GID1b、GA20ox2和GA3ox1的表达量都较高,即GA信号通道相关基因表达量跟随RGL2基因变化而变化。我们进一步采用低温处理使转基因杨树提前进入休眠,观察其表型结果发现,转基因杨树株高均低于对照,且在同一时期,转基因杨树叶子较对照绿,叶子衰老较慢。上述结果可以推测是由于PmRGL2基因过表达,使转基因杨树休眠延迟。3.以‘桃形梅’花芽为试材,运用qRT-PCR分析了 PmSLY1基因在不同休眠时期的表达水平。试验结果表明:花芽进入内休眠时期时,PmSLY1基因表达量开始下降;而在生态休眠时期,该基因表达量开始升高,当达到一定水平时,即开始进入休眠解除时,表达量又开始降低,整个休眠期PmSLY1基因表达量趋势表现为“降-升-降”。可初步预测在赤霉素信号通道中SLY1基因与DELLA的降解有关。4.成功构建了酵母双杂交表达载体猎物载体pGADT7-PmSLY1和诱饵载体pGBKT7-PmRGL2。对酵母双杂交重组质粒进行毒性检测,结果表明,重组诱饵质粒pGBKT7-PmRGL2和重组猎物质粒pGADT7-PmSLY1分别转入Y2H Gold、Y187酵母菌株后,在缺陷培养基上长出的单菌落长势良好,其密度和大小与空载体相比没有明显差异,表明重组质粒对酵母菌株没有毒性作用。自激活检测结果表明,猎物蛋白PmSLY1和诱饵蛋白PmRGL2都不能够在QDO(SD/-Leu/-Trp/-Ade/-His)缺陷培养基上生长,即它们自身没有转录激活活性。将重组质粒pGADT7-PmSLY1、pGBKT7-PmRGL2共转化进Y2H Gold酵母菌株进行酵母双杂交实验。结果表明,PmSLY1与PmRGL2蛋白之间存在互作。
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