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树突状细胞（Dendritic cells, D C）是机体免疫系统中功能最为强大的专职抗原递呈细胞（Antigen presenting cells, APC）,是启动、调控并维持免疫应答的中心环节,其活化与成熟对增强抗原诱导的黏膜免疫应答起到至关重要的作用,因此对防龋疫苗发挥免疫防龋效应也具有重要意义。树突状细胞可通过其表面大量的Toll样受体（Toll-like receptors, TLRs）识别病原微生物而活化并成熟,发挥重要的免疫功能,目前已有多种Toll样受体配体（Toll-like receptor ligands,TLR-Ls）作为疫苗的佐剂,用以增强疫苗诱导的免疫应答,提高疫苗的应用有效性。目前已有多种微生物的病原相关分子模式（Pathogen associated molecular patterns, PAMPs）被证实可通过与抗原递呈细胞表面的TLRs直接结合而被识别,进而启动宿主免疫反应。FimH蛋白是表达于许多肠道杆菌表面的Ⅰ型菌毛末端的粘附素,是可与甘露糖特异性结合的结构,已有研究证明其具有良好的免疫原性,可作为候选疫苗,用于预防尿路致病性大肠杆菌（[Jropathogenic Escherichia coli, UPEC）所导致的尿路感染等疾病。并且,新近的研究认为FimH粘附素是一种新型的TLR4配体,可体外直接激活巨噬细胞和自然杀伤细胞（Natural killer cells, NK细胞）。基于以上研究背景,本研究拟观察两种细菌来源的FimH重组蛋白在体外对小鼠不成熟树突状细胞的活化和促进成熟作用,并初步探索其分子机制；并将FimH重组蛋白作为佐剂联合本课题组已开发的防龋疫苗免疫小鼠,以期为提高防龋疫苗的免疫效应发现新的佐剂。本研究内容包含以下三个部分：第一部分 FimH重组蛋白体外活化DC 2.4细胞系的研究本研究利用已构建的,分别表达大肠杆菌E.coli K-12和鼠伤寒沙门氏菌Salmonella typhimurium两种细菌的FimH基因的重组质粒pET28a-FimH-K12和pET28a-FimH-S.T,原核表达并纯化了FimH-K12和FimH-S.T.两种重组蛋白,采用SDS-PAGE电泳分析了重组蛋白的正确性和纯度。将FimH-K12 和 FimH-S.T.两种重组蛋白以终浓度100ng/ml刺激小鼠未成熟树突状细胞系DC2.4, LPS（终浓度1Ong/ml）刺激为阳性对照并设空白对照组,以研究FimH-K12 和 FimH-S.T.对DC2.4的体外活化、促进其成熟的作用。DC2.4细胞经刺激6小时后采用实时定量RT-PCR （Realtime Quantitative RT-PCR）检测细胞内IL-6 IL-10、IL-12p35、 IL-12p40的mRNA表达水平；经刺激24小时后以流式细胞技术（Flow Cytometry,FCM）分析DC2.4表面CD40, CD80, CD83, CD86和MHC-Ⅱ类分子的表达变化,采用免疫酶联吸附实验（Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）检测细胞培养上清中细胞因子IL-6、IL-10、IL-12p70的含量。结果：DC2.4细胞经蛋白FimH-K12、FimH-S .T.体外刺激,表面标记分子的表达上调,细胞因子的mRNA表达水平及分泌量均明显增加,与LPS体外活化DC2.4细胞的作用相似,提示蛋白FimH-K12、FimH-S.T.可体外直接活化DC2.4细胞促进其成熟。第二部分FimH重组蛋白经TLR4活化DC2.4细胞系及相关通路的研究本研究首先将FimH-K12和FimH-S.T.重组蛋白（终浓度均为100ng/ml）、LPS（终浓度lOng/ml）分别刺激DC2.4细胞,24小时后采用流式细胞术分析细胞表面TLR4的表达水平,以观察FimH-K12和FimH-S.T.重组蛋白对DC2.4细胞的TLR4的调节作用,且与LPS作用是否一致。再采用TLR4抗体拮抗DC2.4细胞表面的TLR4分子后,将两种FimH重组蛋白和LPS刺激DC2.4细胞24小时检测所分泌细胞因子的水平。结果：经重组蛋白FimH-K12. FimH-S.T.和LPS分别作用后,DC2.4细胞表面TLR4表达均显著上调；且TLR4经抗体阻断后DC2.4细胞受重组蛋白FimH-K12、FimH-S.T.和LPS刺激分泌细胞因子的水平受到明显抑制,以上结果证明FimH重组蛋白可经TLR4活化DC2.4细胞。蛋白质免疫印迹实验（Western Blot）检测蛋白FimH-K12、FimH-S.T.和LPS刺激DC2.4细胞后MAPK信号通路的p38、JNK和ERK激酶磷酸化水平的改变,及NF-κB信号通路的变化。结果：蛋白FimH-S.T.均可引起DC2.4细胞内早期即发生MAPK信号通路的p38、JNK和ERK激酶的磷酸化并激活NF-κB信号通路,与LPS的作用基本一致。第三部分 FimH重组蛋白增强防龋疫苗粘膜免疫反应的研究本研究以防龋DNA疫苗PCIA-P于0周初免6-8周龄的BALB/c雌性小鼠,重组蛋白PAc第2周加强免疫,经鼻腔滴注方式免疫,设PBS对照、不加佐剂组和FimH-K12、FimH-S.T.蛋白（10μg/只/次）分别作为佐剂组。于免疫接种前（第0周）和初次免疫后第2、4、6、8、10、12、16和20周采集小鼠的血清和唾液样本,采用ELISA方法检测样本中特异性抗体的水平,并比较特异性IgG1/IgG2a的比值变化趋势；于第8周处死每组6只小鼠取脾脏,进行脾细胞上清中细胞因子含量的检测。结果：FimH-K12. FimH-S.T.蛋白分别作为佐剂联合防龋疫苗免疫小鼠,可诱导唾液和血清中特异性抗体水平明显升高。未加佐剂的DNA疫苗初免、rPAc蛋白加强组以诱导Th2型免疫反应为主,而加入FimH-K12 FimH-S.T.蛋白作为佐剂的两组均为Thl和Th2混合型免疫反应。