抗坏血酸是植物原生质体外抵御氧化胁迫、并维持原生质体外氧化还原动态平衡的有机小分子。抗坏血酸氧化酶(ascorbate oxidase,AO)催化抗坏血酸氧化生成脱氢抗坏血酸,调控质体外的氧化还原状态。已有研究发现AO参与多种生理进程和非生物胁迫的响应。我们前期研究发现烟草中AO的表达水平受低温影响,但具体机理不清楚。为分析AO响应低温的分子机理,本研究以野生型烟草K326为材料,克隆AO启动子,分析部分删除后的AO启动子活性,明确AO启动子中响应低温的顺式作用元件,从而探究低温诱导AO表达的分子机理。主要研究结果如下:根据烟草AO基因第一个外显子5’端序列设计Genome Walking引物,经过两轮巢式PCR,得到了ATG上游1669bp的启动子序列,利用PLACE等启动子分析软件分析显示,AO启动子区除了存在基本的核心启动子元件外,还存在多个参与逆境胁迫的顺式作用元件。包括激素响应元件、光响应元件、脱水响应元件、糖响应元件等。其中低温直接或者间接相关的顺式作用元件有MYB1AT、MYBCORE、MYCCONSENSUSAT等。推测AO的表达还可能受激素、糖信号、逆境相关等信号的调控。根据AO启动子上预测到的低温响应元件的种类和分布,设计7个5’端部分删除的启动子片段,并分别构建入p Cambia1391载体。将所构建的p Cambia1391-AOP-GUS融合表达载体利用浸花法转化col型拟南芥。经潮霉素抗性筛选和PCR鉴定,至T2代,每个启动子片段均获得3个以上转基因纯合株系。对转基因株系分别进行低温0天、1天、3天、5天处理后,检测叶片中的GUS表达水平。低温处理一天后,叶片中所有GUS基因的表达水平都降低,但随着启动子的延长,P7的表达水平较高,P6和P5显著降低,P4又恢复至对照水平的0.87倍,暗示P6和P7之间、P4和P5之间都可能存在响应短期低温的顺式作用元件,且作用相反。对低温处理后的转基因拟南芥纯合株系进行GUS组织化学染色,结果表明:低温处理后,叶片中GUS染色颜色变化不明显,但基本与q PCR结果一致。而根、叶柄处的差异较为明显。可能由于烟草AO启动子中含有组织特异性表达相关的元件,但也不排除外源基因启动子在拟南芥中的表现与原物种出现差异的可能性。