肠炎沙门菌是在全球范围内沙门菌感染中备受关注的血清型之一,是重要的食源性病原菌。食入被污染的肉制品(主要是禽类)及蛋制品是人类感染肠炎沙门菌的主要来源。目前肠炎沙门菌对家禽的致病机制的研究虽然取得了一定的进展,但仍处于初级阶段。虽然控制家禽肠炎沙门菌病的商品化疫苗很多,但达到完全保护力的却没有。因此加强对肠炎沙门菌致病机制、新的药物靶点及疫苗候选株的研究显得尤为重要。体内诱导抗原技术(IVIAT)是一种利用宿主感染血清筛选体内表达的抗原基因的技术,其融合了免疫学与基因组学原理和方法,鉴定出的基因可能在病原体感染宿主的过程中起重要作用,为诊疗技术及疫苗研发等提供新线索。1.肠炎沙门菌基因组表达文库的构建首先,提取高纯度的肠炎沙门菌CMCC50041基因组,用限制性内切酶Sau3A I对基因组进行不完全酶切,使所得片段在0.4-2.7kb范围内,切胶回收酶切片段。其次,用Sau3A I的同尾酶BamH I酶切诱导型表达载体pET30-a/b/c(+),再用去磷酸化酶SAP去除载体5’-末端磷酸基,沉淀回收。然后,用T4连接酶将基因组片段与处理过的载体连接,将连接产物转化至高效感受态细胞E.coli DH5a,并用载体特异性引物检测片段插入效率及大小分布情况,提取质粒保存于-70℃。结果显示,基因组片段插入效率达到90%以上且分布均匀,所构建的文库的库容量为1.68×105个克隆,可覆盖基因组接近5次。2.利用IVIAT筛选肠炎沙门菌的体内感染相关因子制备鸡抗血清,选取高滴度血清混合,分别用CMCC50041和大肠杆菌全菌、裂解上清和分泌蛋白吸附血清,然后用CMCC50041和大肠杆菌的全菌抗原、裂解上清以及CMCC50041脂多糖(LPS)进行ELISA测定,以评价吸附效果。采用斑点免疫印迹实验进行IVIAT筛选,经过初筛、SDS-PAGE及二次筛选后确定阳性克隆。最后对阳性克隆进行测序,Blast分析确定其功能。结果显示,筛选得到57个阳性克隆,测序比对后确定了43个编码序列,分别涉及到生物大分子的合成和降解、能量代谢相关分子、膜转运蛋白、调控因子、毒力、其它类和功能未知的蛋白等7类,筛选所得序列参与了细菌在体内生长、繁殖和致病等相关的过程。3.实时荧光定量PCR检测肠炎沙门菌感染相关因子的体内外表达差异本实验采用SYBR?reen实时定量PCR (qRT-PCR)法,通过相对定量分析(2-ΔΔCT)来比较目的基因体内外基因转录水平差异。根据IVIAT筛选得到的43个编码序列,按其类别随机选取10个基因(bigA、 metQ、 SEN3752、 fadJ, rlpA、 glpA、 SEN2804、 SEN3610、 nadR和ssaD)进行试验。以CMCC50041静脉接种鸡,分别在感染后12、24、36和48hr检测上述基因在鸡体内的表达情况。结果显示：除基因fadJ外,大部分基因在这四个时间段的mRNA水平相对于体外均有所上调。其中,多数基因在体内表达呈现一种波动性,如metQ、 bigA、glpA、 SEN2804和SEN3610等；部分基因在体内表达呈现持续上升趋势,如SEN3752和ssaD;部分基因在体内表达呈现持续下降趋势,如rlpA和nadR等。证明IVIAT筛选所得基因为细菌体内感染过程中表达的基因,同时也初步揭示随着感染时间的延长,不同功能的基因在菌体的调控下表达规律呈现时序性、多样性等特点,亦表明在感染过程中存在宿主和细菌相互作用的复杂机制。