十字花科黑腐病菌中表达受酸碱影响的小RNA的鉴定和功能研究

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细菌小RNA(small RNA, sRNA),又称为非编码RNA (non-coding RNA, ncRNA),是一类长度约为50-500bp,通常不编码蛋白质,但又具有独立功能的RNA分子。研究表明,小RNA在细菌的群体感应、碳代谢、致病性、运动性以及应对环境胁迫等生理过程中发挥了关键的调控作用。酸、碱胁迫是细菌在自然生存状态下遇到的环境胁迫的重要方面,细菌对酸碱胁迫的耐受和适应对它们在特定环境条件下的生存和繁殖具有非常重要的意义。尽管人们对细菌对酸碱胁迫的耐受和适应的机理有了较广泛深入的了解,但对小RNA在其中的作用还知之甚少。十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pathovar campestris,Xcc)是引起包括许多重要农作物(如白菜、萝卜、青菜、甘蓝等重要蔬菜,以及油料作物油菜)黑腐病的病原菌,也是研究病原细菌与植物互作分子机制的模式菌之一。为了鉴定Xcc中参与酸碱胁迫的小RNA,本研究中,我们采用RNA测序(RNA-seq)技术,在全基因组水平上鉴定了Xcc中表达分别受酸和碱影响的小RNA,并对部分表达受酸、碱影响的小RNA进行了功能鉴定。首先,通过测定Xcc在不同pH值的NYG丰富培养基中生长受影响的程度,确定用pH4.5和pH10.0的NYG培养基分别代表酸、碱胁迫环境,而pH7.0的NYG培养基作为Xcc生长的正常环境。接着,我们分别在这三种pH值的NYG培养基中培养Xcc8004菌株至对数期,提取总RNA并去除rRNA,然后分别回收50-200nt和201-500nt大小的RNA进行Solexa cDNA库构建和测序。最后,我们用本实验室之前建立的方法对Solexa测序数据进行分析,筛选出表达受酸碱影响的候选小RNA。候选小RNA经Northern杂交或RT-PCR验证后确定为表达受酸碱影响的小RNA。结果,我们发现了477个表达受酸影响,53个表达受碱影响的候选小RNA(其中27个表达既受酸也受碱的影响)。目前已有28个表达受酸碱影响的小RNA(其中13个表达受酸影响、1个表达受碱影响和14个表达同时受酸和碱影响)通过了Northern杂交或RT-PCR验证。为了证实这些表达受酸、碱影响的小RNA是否参与Xcc的酸碱胁迫过程,我们通过缺失和过量表达两种方法对这些小RNA的功能进行研究。目前已经完成了5个小RNA(sR2160-2161、sR2483-2484、 sR2484-2485、sR4019-4020和sR1332-1333)的缺失突变体和4个小RNA(sR2160-2161、sR2483-2484、sR2484-2485和sR4019-4020)的过量表达株构建和表型分析。酸、碱胁迫耐受性检测实验结果显示,尽管所有缺失突变体对酸和碱的耐受性和野生型菌株Xcc8004的耐受性没有显著差异,但是,小RNA sR2160-2161、sR2483-2484和sR4019-4020的过量表达株对酸和碱的耐受性比携带有空的过量表达载体野生型菌株(Xcc8004/pB)对酸和碱的耐受性显著降低,说明这三个小RNA在Xcc对酸和碱胁迫的耐受中起重要作用。小RNA sR2484-2485的过量表达株对酸的耐受性比Xcc8004/pB的耐受性显著降低,但对碱的耐受性和Xcc8004/pB没有显著差异,说明这个小RNA在Xcc对酸胁迫的耐受中起重要作用,而在对碱胁迫的耐受中没有或只起微弱作用。为了了解这几个小RNA在Xcc对其它胁迫的适应中的作用,我们又检测了它们的缺失突变体和过量表达株对重金属离子(包括Ni2+、Cu2+、Zn2、Co2+、Mn2+、Cd2+)、SDS和NaCl的耐受性。结果说明sR2160-2161、sR2483-2484、sR2484-2485和sR4019-4020在Xcc对过量重金属离子的耐受中起重要作用,而sR2483-2484和sR2484-2485在Xcc对SDS的耐受中起重要作用。此外,我们还检测了这些小RNA缺失突变体和过量表达株的致病力、HR反应能力和致病因子的产生。检测结果显示,和Xcc8004/pB相比,小RNA sR2160-2161、sR2483-2484、sR2484-2485和sR4019-4020的过量表达株的致病力减弱、HR反应延迟、胞外酶减少,但胞外多糖产量没有显著变化。小RNA sR2160-2161、sR2484-2485和sR4019-4020的缺失突变体的致病力比野生型菌株Xcc8004显著下降。这些结果说明,小RNA sR2160-2161、 sR2483-2484、sR2484-2485和sR4019-4020在Xcc对寄主的致病力、非寄主的HR反应以及致病因子胞外酶产生的过程中起重要作用。总之,我们采用RNA测序方法在Xcc8004中鉴定了几百个表达受酸碱影响的候选小RNA,其中28个通过了Northern杂交或半定量RT-PCR验证。更重要的是,我们发现了4个在Xcc对酸碱胁迫的耐受以及在致病和致病因子产生中起重要作用的小RNA。我们的结果为研究小RNA在Xcc对酸碱胁迫的耐受以及致病过程中的作用打下了坚实基础。
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