胶原蛋白是一种广泛分布于机体中的功能性结构蛋白,约占机体总蛋白含量的1/3,主要起着支撑器官、修复损伤、传递信息等作用。胶原蛋白及其相关产品在医疗、食品以及日化等领域应用广泛,但传统胶原蛋白制备主要采用提取法,具有含免疫原成分、收率低、污染环境等问题。随着现代生物技术和合成生物学的快速发展,利用基因重组并结合高密度发酵技术对胶原蛋白进行外源表达逐步受到关注,具有广阔的发展前景。本论文围绕课题组保存的一段Ⅲ型类人胶原蛋白（hlCOLⅢ）编码基因,开展了基因工程菌的构建、分子改造、罐上发酵工艺、胶原蛋白的分离纯化与结构表征等系统性研究。论文的主要研究内容如下:（1）hlCOLⅢ表达体系的筛选。根据Ⅲ型类人胶原蛋白基因col设计引物并扩增,将其连接至p ET-28a（+）、p MA5、p PIC9K和p GAPZ（α）A载体并导入大肠杆菌、枯草芽孢杆菌以及毕赤酵母宿主中,分别构建了Escherichia coli Rosetta（DE3）/p ET-28a（+）-col、Bacillus subtilis WB600/p MA5-col、Pichia pastoris GS115/p PIC9K-col以及P.pastoris GS115/p GAPZ（α）A-col不同重组菌进行初始表达。通过SDS-PAGE以及western blotting分析,确定hlCOLⅢ在重组菌Rosetta（DE3）/p ET-28a（+）-col与GS115/p PIC9K-col中均表达成功,而在WB600/p MA5-col以及GS115/p GAPZ（α）A-col重组菌中无明显表达,其中GS115/p PIC9K-col中初始表达量最高,为0.031 g·L-1,后续试验在该重组菌基础上展开。（2）重组菌的启动子工程改造、发酵优化以及扩大培养。通过构建单启动子与双启动子以提升重组菌hlCOLⅢ的分泌表达水平,得到提升效果最显著菌株GS115/p PIC9K-PDAS2-col,表达量为0.086 g·L-1,是出发菌株的2.7倍。进一步在BMGY、BMMY发酵培养基的基础上进行了初步摇瓶发酵优化,实验研究表明,采用优化后配方:10.0 g·L-1葡萄糖为初始碳源,20.0 g·L-1大豆蛋白胨、10.0 g·L-1可溶性黄豆饼浸粉作为氮源,每12h补充0.75%甲醇进行诱导的条件下,摇瓶表达量最高可达0.142 g·L-1。经5 L罐上放大研究,甘油补料至菌体湿重为200 g·L-1左右时停止补料,饥饿处理2 h后开始甲醇诱导,最终hlCOLⅢ产量在66 h达到峰值,为1.05 g·L-1。（3）hlCOLⅢ的分离纯化与结构表征。采用镍离子亲和层析对hlCOLⅢ进行分离纯化,经SDS-PAGE验证,观察到27 k Da处有单一的目的条带且纯度可达96%。对纯化产物透析及冻干处理后进行结构表征,N端和C端的蛋白测序结果与理论序列一致,且所测定的序列中部分含有（Gly-X-Y）n重复序列,符合胶原蛋白的特征;氨基酸序列分析表明该蛋白中甘氨酸含量最多,占27.02%,脯氨酸次之,约23.92%;质谱分析结合Native-PAGE显示其实际分子量为11.3 k Da,且在发酵上清中以同源二聚体或者三聚体的形式存在;紫外扫描、红外光谱以及圆二色谱分析表明该蛋白与未成熟的非三螺旋结构胶原蛋白谱图特征相符,这为今后进行胶原蛋白自组装的研究奠定了基础。