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背景:非小细胞肺癌（non-small cell lung carcinoma,NSCLC）在肺癌（lung cancer）中约占80%,恶性程度高,其治疗的主要方法是手术切除、放射治疗和化学药物治疗（化疗）。化疗对NSCLC患者体内各处的肿瘤细胞都有杀伤作用,适用于各临床阶段的NSCLC患者,这是其它治疗方法所不能替代的。然而,传统化疗药物对肿瘤杀伤特异性差,损伤正常体细胞,不可避免地产生毒副作用,因此其临床应用受到一定制约。近年来,国际上提出了精准医学（precision medicine,PM）的新兴医疗概念,使人们更重视疾病的深度特征以及治疗药物的高度精准性。分子靶向药作为精准药物的代表因其作用靶点明确、特异性强、毒副作用小等特点,可与传统化疗药互补,已逐渐成为治疗肿瘤的一线药物。用于治疗NSCLC的分子靶向药物是以吉非替尼（gefitinib）为代表的表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitors,EGFR-TKI）。研究表明,亚裔、女性、非吸烟的肺腺癌患者易从EGFR-TKI中受益,这些患者多携带EGFR基因第18、19或21外显子突变。因此,EGFR-TKI成为治疗这类患者必不可少的药物。然而随着EGFR-TKI临床应用时间的推移,人们发现原本对此类药物敏感的NSCLC患者在接受该药治疗一段时间后会出现获得性耐药（acquired drug resistance）,这很大程度地限制了 EGFR-TKI的疗效。目前公认的与EGFR-TKI获得性耐药产生相关的机制中最主要是EGFR基因发生二次突变,如EGFR基因第20外显子T790M突变等。临床上约半数EGFR-TKI获得性耐药NSCLC患者的肿瘤细胞携带有T790M突变。T790M突变在NSCLC患者产生EGFR-TKI获得性耐药过程中的作用尚未完全明确。人们普遍认为是T790M突变改变了 EGFR-TK域蛋白构象,阻碍其与TKI的结合,恢复其与ATP的结合,进而重新开放EGFR增殖信号转导通路。课题组前期工作发现携带T790M突变的NSCLC细胞NCI-H1975在发生EGFR-TKI获得性耐药后并未出现EGFR通路的重新激活,而是发生上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）。这个发现提示EMT可能是携带T790M突变的NSCLC细胞逃逸EGFR-TKI攻击的重要方式。因此,促进NSCLC细胞发生EMT的因素可能是NSCLC细胞产生EGFR-TKI获得性耐药的因素。细胞EMT的启动受多种信号因子调控,其中最重要的细胞因子是转化生长因子 β（transforming growth factor-β,TGF-β）,而 TGF-β1 是 TGF-β 最具代表性的亚型。在体内,包括肿瘤细胞、巨噬细胞在内的多种细胞都可以分泌TGF-β1,多种细胞表面分布有其受体。在EGFR-TKI作用时TGF-β1能否促进携带T790M的NSCLC细胞发生EMT进而产生获得性耐药,值得探讨。目的:本研究通过检测在有无TGF-β1存在条件下,携带T790M突变的NSCLC细胞株NCI-H1975对EGFR-TKI的敏感性差异,拟证明TGF-β1通过促进该细胞发生EMT进而使其产生EGFR-TKI获得性耐药,以期为临床预防和逆转NSCLC患者的EGFR-TKI获得性耐药提供新的思路。方法:1.研究对象及培养条件（1）选择携带T790M突变的NSCLC细胞株NCI-H1975为实验对象（2）培养条件:在37℃、5%CO2、饱和湿度条件孵箱中,用RPMI-1640完全培养基（含10%标准胎牛血清和1%双抗）培养。2.Gefitinib实验浓度与作用时间选择（1）Gefitinib实验浓度选择:MTT 比色法测定gefitinib对NCI-H1975的抑制率,计算IC50并选择最接近IC50的整十浓度为gefitinib实验浓度（gefitinib浓度范围:40μmol/L至1.25μmol/L倍比稀释6个浓度）。（2）Gefitinib作用时间选择:以10μmol/L浓度,将gefitinib加入至NCI-H1975细胞中,观察药物作用24h和48h后的NCI-H1975细胞存活情况,以确定gefitinib作用时间。3.TGF-β1实验浓度与作用时间选择（1）TGF-β1实验浓度选择不同浓度的TGF-β1作用于gefitinib存在下的NCI-H1975细胞（TGF-β1浓度:40、20、10、5与0ng/m1）。1)倒置显微镜观察细胞的生长状态;2)MTT法检测gefitinib对经不同浓度TGF-β1处理的NCI-H1975细胞的IC50,并计算相应耐药指数;3)根据细胞生长状态稳定程度和IC50值确定TGF-β1实验浓度。（2）TGF-β1作用时间选择以已确定的TGF-β1浓度,将TGF-β1加入NCI-H1975细胞,分别作用24h和48h后,再加入浓度为10μmol/L的gefitinib作用24h。根据细胞存活情况确定TGF-β1作用时间。4.TGF-β1对NCI-H1975细胞的gefitinib敏感性影响的研究（1）根据是否有TGF-β1和gefitinib作用于细胞,将细胞分为四组:NCI-H1975 组:无 TGF-β1和gefitinib 作用的 NCI-H1975 细胞;NCI-H1975/TGF 组:只有10ng/ml 的 TGF-β1 作用 48h 的 NCI-H1975 细胞;NCI-H1975/G 组:只有 10μmol/L 的 gefitinib 作用 24h 的 NCI-H1975 细胞;NCI-H1975/G/TGF组:经10ng/ml的TGF-β1作用48h后不弃去培养液再加入10μmol/L 的 gefitinib 作用 24h 的 NCI-H1975 细胞;（2）倒置显微镜观察四组细胞的生长状态;（3）细胞计数仪检测活细胞比例和密度;（4）细胞计数法绘制四组细胞生长曲线,计算相应群体倍增时间;（5）MTT 比色法检测gefitinib对四组细胞的抑制率并计算相应IC50及耐药指数;（6）台盼蓝拒染法计数活细胞,绘制gefitinib对细胞的生长抑制曲线;5.TGF-β1对gefitinib存在下NCI-H1975细胞发生EMT的影响的研究（1）免疫细胞化学检测细胞EMT标记蛋白E-cadherin和Vimentin表达情况。（2）Western-blot法检测细胞中E-cadherin和Vimentin蛋白含量的变化。结果:1.NSCLC细胞株NCI-H1975呈梭形,贴壁生长,胞质饱满,胞膜光滑。2.Gefitinib对NCI-H1975 的 IC50为 12.61±1.33μmol/L,选择接近IC50值的 10μmol/L为gefitinib实验浓度;确定gefitinib作用时间为24h。3.经 40、20、10、5 与 Ong/ml 浓度 TGF-β1 和 10μmol/L 的 gefitinib 作用 24h 后的细胞生长状态和gefitinib对细胞的IC50结果显示:（1）有TGF-β1作用的NCI-H1975细胞均比没有TGF-β1作用的NCI-H1975细胞生长状态好;（2）gefitinib对经40、20、10与5ng/mlTGF-β1处理的细胞IC50值分别为57.84±1.38μmol/L、51.36±2.66μmol/L、39.38±1.74μmol/L和29.59±1.81μmol/L,具有浓度依赖关系。相应的细胞耐药指数为4.57、4.07、3.12与2.35;（3）根据上述结果结合细胞的生长状态稳定程度,选择10ng/ml为TGF-β1实验浓度;（4）确定TGF-βl作用时间为48h。4.NCI-H1975、NCI-H1975/TGF、NCI-H1975/G与NCI-H1975/G/TGF细胞对gefitinib耐药性变化（1）与NCI-H1975/G相比,NCI-H1975/G/TGF细胞存活数目多、胞质饱满、胞膜光滑清晰,NCI-H1975和NCI-H1975/TGF细胞则正常生长,未见有明显形态变化;（2）活细胞计数显示:NCI-H1975/G/TGF的活细胞密度为（0.76±0.063）×105/ml,明显高于NCI-H1975/G 的（0.24±0.015）×105/ml（P<0.05）;（3）由细胞生长曲线得 NCI-H1975、NCI-H1975/TGF、NCI-H1975/G和NCI-H1975/G/TGF 细胞的群体倍增时间分别为 46.54±3.79h、48.22±2.08h、46.45±4.27h、44.58±2.17h,NCI-H1975/G/TGF 细胞的增殖速度加快,比NCI-H1975/G细胞缩短了 1.87h（P>0.05）;（4）Gefitinib对NCI-H1975、NCI-H1975/TGF、NCI-H1975/G和NCI-H1975/G/TGF细胞的 IC50 分别为 12.61±1.33μmol/L、16.98±0.50μmol/L、12.43±1.19μmol/L 和29.75±2.30μmol/L,NCI-H1975/G/TGF 的 IC50 比 NCI-H1975/G 细胞的 IC50 提高了1.39 倍（P<0.05）;（5）Gefitinib对细胞的生长抑制曲线显示:在10与20μmol/L浓度的gefitinib存在条件下,四组细胞的活细胞数均随着gefitinib作用时间增加而减少,但NCI-H1975/G/TGF的细胞数在前三天下降幅度小,并且在观察内同一药物作用时间点,NCI-H1975/G/TGF 的活细胞数目均比其它三组细胞多,提示NCI-H1975/G/TGF 对 gefitinib 的耐药性增强;5.免疫细胞化学和Western-blot法检测EMT标记蛋白表达情况,结果均显示:与NCI-H1975、NCI-H1975/TGF和NCI-H1975/G细胞相比,NCI-H1975/G/TGF细胞的EMT标记蛋白E-cadherin表达减弱和Vimentin表达显著增强,表明NCI-H1975/G/TGF 细胞有发生 EMT 的倾向（P<0.05）。结论:1.TGF-β1对携带T790M突变的NSCLC细胞株NCI-H1975产生EGFR-TKI获得性耐药有促进作用。2.在EGFR-TKI存在下,TGF-β1对NSCLC细胞株NCI-H1975的保护作用具有浓度依赖性。3.TGF-β1促使携带T790M突变的NSCLC细胞NCI-H1975在gefitinib存在下发生EMT,可能是其促进细胞发生EGFR-TKI获得性耐药的机制。