巴贝斯虫病(babesiosis)原被称焦虫病或血孢子虫病,是蜱传播的一类人畜共患血液原虫病的总称。而牛巴贝斯虫病(bovine babesiosis)是世界各国公认的危害养牛业最重要的寄生虫病之一。2003年,Wilkowsky等人发现牛巴贝斯虫MSA-2c蛋白含有高度的免疫源性和保守性的B细胞表型,可诱发牛产生敏感的中和抗体。这些研究提示MSA-2c蛋白可作为牛巴贝斯虫病检测的一种稳定的诊断工具,也可作为预防牛巴贝斯虫病基因工程亚单位疫苗的候选者。因此,研究MSA-2c基因及其编码蛋白已成为诊断和预防牛巴贝斯虫病的一个焦点。本研究工作主要包括以下三部分:1牛巴贝斯虫MSA-2c基因的克隆及序列分析利用GenBank中发表的牛巴贝斯虫MSA-2c基因序列,设计特异引物,以发病牛的全血基因组作为模板,通过PCR扩增方法,获得新疆牛巴贝斯虫MSA-2c基因,测序结果显示,序列全长为798bp,为一个完整的开放阅读框,由核酸序列推演出蛋白质分子量为29kDa,含267个氨基酸残基。核酸序列及蛋白序列同源性分析,新疆牛巴贝斯虫MSA-2c基因与国际标准株相比有一个碱基的突变,蛋白质序列未发生变化。证明本研究在国内首次成功克隆了牛巴贝斯虫疫苗候选基因MSA-2c基因。2牛巴贝斯虫MSA-2c基因的原核表达、重组蛋白的纯化及免疫反应性研究构建了重组原核表达载体pGEX-4T2/MSA-2c,用CaCl2法转化大肠杆菌,获得多拷贝重组菌株,经IPTG诱导表达,谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B (Glutathione Sepharose 4B)纯化后,SDS-PAGE和Western-Blot分析结果表明,诱导表达的pGEX-4T2/MSA-2c阳性菌株表达出大小为55kDa,具有反应活性的重组蛋白。ELISA试验显示,重组蛋白免疫的试验小鼠抗体效价可达1:220,000以上,证明MSA-2c基因的重组蛋白可作为牛巴贝斯虫病检测的一种稳定的诊断工具,也可作为预防牛巴贝斯虫病基因工程亚单位疫苗的候选者。3牛巴贝斯虫MSA-2c基因的真核瞬时表达、重组质粒的纯化及免疫反应性研究重组质粒pCDNA3.1+/MSA-2c尾静脉注射试验用小白鼠,利用小鼠体细胞进行真核表达后,取其肝脏提取总RNA,RT-PCR结果显示,重组质粒pCDNA3.1+/MSA-2c能在小鼠体内瞬时表达。肌肉注射重组质粒4次后,取阳性血清作为抗体,纯化的GST融合蛋白作为抗原进行Western-Blot检测,可得到目的条带,ELISA试验显示,重组质粒免疫的试验小鼠抗体效价可达1:100,000以上,证明重组质粒作为核酸疫苗免疫动物具免疫反应性。