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纤毛虫原生动物是一类高度分化的单细胞真核生物,分布于几乎所有生境。许多纤毛虫的营养细胞可以在恶劣的环境条件下转化为包囊细胞来维持生存,这是一种高级的生存策略。迄今为止,对纤毛虫包囊形成的研究已具有长久的历史。其中,许多研究报道了包囊形成的诱导因素、形态结构变化过程以及生理生化变化,但从基因、miRNA和lncRNA分子水平综合探究纤毛虫包囊形成的相关机制仍然较少。本研究在前人研究基础上,选取易培养、繁殖周期短、易感知环境变化、易形成包囊的冠突尾伪柱虫（Pseudourostyla cristata）为实验材料,应用全转录组测序（RNA-seq）技术、qRT-PCR技术和生物信息学分析,获得营养细胞和包囊细胞的全转录组学数据,系统地分析比较纤毛虫包囊形成前后相关基因、miRNA、lncRNA的变化,并提出了调控包囊形成的信号网络假说。这些结果不仅有助于揭示纤毛虫包囊形成的分子机制,也为深入了解真核生物抵抗逆境的作用机制提供基础资料。1.转录组测序揭示冠突伪尾柱虫包囊形成的相关基因及其分子机制本研究利用Illumina HiSeq X Ten测序仪对冠突伪尾柱虫营养细胞和包囊细胞转录组进行高通量测序,结果显示:（1）共检测到2565个差异基因,其中有1708个基因表达上调,而857个基因表达下调。（2）注释到GO数据库的总差异基因为1752个,将差异unigene注释到1993个GO条目中,其中相比于营养细胞,包囊细胞上调1424个条目,下调1021个条目,这些差异条目主要涉及翻译、核糖体、RNA结合、果胶分解代谢、聚胺转运、核糖体结构组成等内容。（3）差异基因共映射到224个不同的信号通路中,与营养细胞相比包囊细胞上调184条pathway,下调162条pathway。其中显著富集的通路有Ribosome、Oxidative phosphorylation、Carbon metabolism和Lysosome等。（4）随机选取的7个mRNA的qRT-PCR结果与转录组学测序结果相一致,证明本转录组学数据可靠。（5）包囊细胞与营养细胞相比,SOD和GPX的活性显著增加,SOD和GPX的表达上调增强抗氧化应激。钙离子信号通路在冠突伪尾柱虫包囊形成因素中占据诱导位置,泛素介导的蛋白降解途径的激活揭示了包囊形成过程中蛋白质降解明显增强,FOXO信号通路参与调控包囊自噬功能的增强,抗氧化作用的提高,以及减弱了能量代谢等过程,这些生物学过程由多种基因如CALM、AMPK、SOD、ATG8、F-actin和cyclinA等共同参与调节,有效地促进包囊细胞的形成。基于这些结果,提出了调控冠突伪尾柱虫包囊形成的信号网络假说。2.高通量小RNA测序揭示miRNA调控冠突伪尾柱虫包囊形成的调控机制我们使用Illumina高通量测序平台鉴定和分析冠突伪尾柱虫包囊形成过程中起调控作用的差异表达miRNA及其调控靶基因。结果显示:（1）在包囊细胞和营养细胞之间总共鉴定出了449个差异表达miRNA,与营养细胞相比,包囊细胞中有243个和206个miRNA分别被上调和下调。（2）GO分析表明差异表达miRNA的靶基因在与细胞质有关的功能中富集。差异miRNA靶转录本总共注释到了1421条GO term,差异miRNA靶基因在生物学过程中主要富集在translation,在细胞成分中主要富集于cytoplasm,在分子功能中主要富集于ATP binding。（3）信号通路主要显著富集在Carbon metabolism、Biosynthesis of amino acids、Fatty acid degradation、Two-component system和Glycolysis/Gluconeogenesis等信号通路中。（4）随机选取的13个miRNA,有12个qRT-PCR结果与转录组学测序结果相一致,证明对冠突伪尾柱虫营养细胞和包囊细胞的高通量小RNA测序有效并且可信。我们通过生物信息学分析重点研究了与包囊形成密切相关的多个miRNA,如miR-23b-3p、miR-370-3p、miR-28、miR-12304、miR-744-5p、miR-145、miR-1307、miR-1180、miR-106b-3p和miR-143等。其中,miR-12304、miR-744-5p和miR-145等通过负调控HtrA、UQCRFS1和GlnA等基因参与双组分系统通路,和调控F-actin、SGK、CPT1、GPX等基因的miRNA共同调控微丝骨架、cAMP和PI3K-AKT等信号通路,协同促进包囊形成。我们综合了上述差异表达miRNA及其调控的靶基因和信号通路的潜在作用,提出了miRNA调控冠突伪尾柱虫包囊形成的信号网络假说。3.冠突伪尾柱虫包囊形成相关lncRNA表达谱的鉴定和分析我们应用高通量lncRNA测序的方法检测、分析冠突伪尾柱虫包囊细胞和营养细胞的lncRNA表达谱。结果显示:（1）在包囊细胞和营养细胞之间总共鉴定出了853个差异表达的lncRNA,和营养细胞相比,包囊细胞中上调和下调的lncRNA分别为439和414个,有21个lncRNA在营养细胞中特异性表达,47个lncRNA在包囊细胞中特异性表达。（2）应用qRT-PCR验证随机选取的16个lncRNA的表达结果与高通量lncRNA测序结果高度一致,证明高通量lncRNA测序结果高度可信。（3）为了揭示这些差异lncRNA的相关功能,我们做了差异lncRNA和mRNA的共表达分析,并聚焦于上调的TRINITYDN12058c0g1i12和TRINITYDN20924c0g1i22,以及下调的TRINITYDN30855c0g1i11。TRINITYDN12058c0g1i12的共表达mRNA有htpG（HSP90α）、ATP1、ATP6、ND4、ND5和COX3等,这些基因在增强细胞自噬和蛋白质降解及细胞逆境耐受性上发挥调控作用,在合成包囊形成所需蛋白质中扮演重要角色,从而促进包囊形成。TRINITYDN20924c0g1i22共表达的上调mRNA主要有UBE1、VAMP7和ORP5/8等,这些基因在促细胞内钙离子浓度的增加和辅助降解包囊形成期间各种异常和损伤的蛋白质中发挥重要作用;相应下调的TRINITYDN30855c0g1i11的共表达的下调mRNA有TTLL、MELK和ICK等,这些基因在调节结构或微管相关动力蛋白与微管之间的相互作用中发挥关键作用,抑制细胞增殖,促进包囊形成。总之,本研究通过应用比较全转录组学测序技术首次获得了完整的冠突伪尾柱虫营养细胞和包囊细胞mRNA、miRNA和lncRNA表达谱。挖掘出包囊形成相关的重要基因、miRNA和lncRNA,探究了和包囊形成相关的钙离子信号通路、泛素介导的蛋白降解途径、双组分系统、氧化磷酸化、cAMP、PI3K-AKT和FOXO等重要信号通路,综上所述,这些结果大大丰富了纤毛虫休眠相关的分子水平研究资料。