论文部分内容阅读
本文以标准蛋白质的混合物、杏仁降压肽为研究对象,采用高速逆流色谱对其进行分离。由于分离对象都具有生物活性,所以选择能够提供温和环境的溶剂体系,以保护生物大分子的活性。能够满足此条件的溶剂体系为：双水相体系,反胶束体系。利用双水相体系逆流色谱进行分离蛋白已有很多报道,但鲜见有关采用高速逆流色谱反胶束体系分离蛋白、多肽的研究报道。本文从流动相等度分离蛋白混合物、流动相梯度分离蛋白混合物、分离纯化杏仁降压肽三方面进行了探索性的研究,并且采用高效液相色谱法对分离开的蛋白质纯度进行了分析。本论文包括5个部分：1.综述首先从高速逆流色谱的工作原理、优点、两相溶剂体系的选择、发展现状四个方面对高速逆流色谱的研究概况进行了综述；然后就反胶束体系形成与结构、种类、萃取机理及影响因素、此体系在蛋白、多肽上的应用现状进行了总结：接着对几种常见标准蛋白质的结构、功效及其分离纯化方法做了概述；最后对生物活性肽功效、分离纯化技术进行了简要概述。2.高速逆流色谱反胶束体系等度分离混合蛋白采用高速逆流色谱法,选用0.02 mol/L AOT的正己烷溶液(0.5 ml Span80)作为溶剂体系的固定相,选用一定PH值的缓冲液作为流动相,在流动相等度的情况下分离混合蛋白。在pH=6.97,0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液(0.1 mol/L KCl)和pH=6.00,0.05 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液(0.1 mol/L KCl)等度的情况下,分别进样牛白蛋白与胶原蛋白的混合物、牛白蛋白、胶原蛋白,然后比较谱峰的出峰时间,从而确定为共流出的关系。类似的在pH=9.00,0.05mol/L Tris-HCl缓冲液(0.1 mol/L KCl)等度的情况下对牛白蛋白和血红蛋白的混合物进行研究,结果相似。3.高速逆流色谱反胶束体系梯度分离蛋白混合物采用高速逆流色谱法对牛白蛋白与溶菌酶的混合物进行分离研究,通过对比十二种反胶束体系其固定相保留率的高低,选择AOT+Span80/正己烷／水作为本实验半制备型高速逆流色谱的两相溶剂体系,正己烷溶液做固定相,一定pH值缓冲盐的水溶液做流动相。本文利用固定相流失产生噪音信号的大小确定500 ml正己烷中加0.5 ml Span80;通过单因素优化法优化试验所得最佳分离条件为：流动相流速为2.0 ml/min,仪器转速为650 rpm,一次分离流动相为pH=8.00,0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液(0.1 mol/L KCl),二次分离流动相为pH=11.95,0.05mol/L Na2HPO4-NaOH缓冲液(0.8 mol/L KCl)。历经两次分离所得馏分,通过高效液相色谱的分析,结果如下：一次馏分为牛白蛋白,其纯度为94.3%；二次馏分为溶菌酶,其纯度为96.6%。4.高速逆流色谱法反胶束体系分离纯化杏仁降压肽采用95℃热水去皮,干燥后粉碎,用正己烷脱脂两次,酸提碱沉提取蛋白,用碱性蛋白酶水解成多肽,超滤膜分离得到1000 Da以下杏仁降压肽。采用高效液相色谱法对其进行初步分离,可以看出其复杂性。然后运用高速逆流色谱对其进行分离纯化,仍然选用上述AOT/Span80/正己烷/水反胶束体系为溶剂体系,流动相为pH=5.00, 0.05mol/L Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液时得到三个峰的一次分离图,用pH=10.00,硼砂--NaOH缓冲液进行二次分离,出现明显的谱峰,说明反胶束体系对复杂的杏仁降压肽混合物有较好的分离功效,但是试验的重现性不好。5.研究总结主要对研究内容进行总结,并对其进行展望。