论文部分内容阅读
目的:随着社会生活水平的不断提高,越来越严重的人口老龄化问题所引发的多种慢性疾病,严重影响国人健康。在所有慢性疾病中,2型糖尿病（Type 2diabetes mellitus,T2DM）引起的骨质疏松骨折发生率也明显高于正常患者。相比于其他类型的骨质疏松,T2DM诱发的骨质疏松的病理机制更加复杂,其骨密度的变化程度不明确,可能降低,不变甚至升高,导致骨折主要的原因往往是骨脆性增加,其具体的发病机制目前仍未研究清楚。骨髓间充质干细胞（Bone mesenchymal stem cells,BMSCs）作为一种骨组织中常见的祖细胞,其分化活跃,能分化成多种类型细胞,尤其是向脂肪和骨的分化,保持着微妙的平衡。一旦该平衡被打破,向脂肪细胞分化的比例高于成骨细胞的时候,机体内总的成骨能力则会下降,是引起骨质疏松的根本原因。Hippo/YAP通路对于细胞的增殖分化具有重要的调控作用。研究表明YAP蛋白广泛参与了各种肿瘤的发生以及T2DM并发症的发生发展过程,细胞内YAP的增加还能调节PI3K通路,进一步通过下游相关分子调控细胞的各个生命过程。同时该通路还广泛参与动物器官的发育。因此我们认为,在2型糖尿病骨质疏松（Type 2 diabetic osteoporosis,T2DOP）的发病过程中,T2DM所导致的YAP蛋白表达增加,抑制了PI3K通路活性,进而导致了BMSCs的成骨分化能力下降及骨质疏松的发生。本实验拟通过建立T2DOP大鼠模型并提取BMSCs,通过转染YAP慢病毒探索其对骨质疏松BMSCs的调控作用,为临床治疗T2DOP提供新的靶点及研究方向。研究方法:（1）提取并检测T2DOP大鼠的BMSCs成骨指标和YAP蛋白的表达:取12周龄SD大鼠20只,随机分为T2DOP组和正常组,T2DOP组腹腔小剂量注射链脲佐菌素结合高脂高糖饲料建立模型,正常组大鼠注射等量生理盐水。两周后检测大鼠空腹血糖、胰岛素并计算胰岛素指数;Micro-CT检测大鼠骨微结构;苏木精-伊红染色观察骨小梁的改变,验证T2DOP模型建立成功。随后全骨髓贴壁法提取两组大鼠BMSCs,通过细胞形态、姬姆萨染色、以及细胞表面抗原标志物的检测,验证我们所取得的细胞确实是BMSCs。然后对两组BMSCs进行成骨以及成脂诱导,检测ALP活力及分泌情况,进一步证明细胞是具有多向分化潜能的BMSCs。RT-PCR检测成骨相关基因OPN、Runx2的表达差异并监测YAP的前14天的动态表达。（2）沉默YAP对T2DOP大鼠BMSCs成骨分化能力的影响:使用慢病毒下调T2DOP BMSCs中YAP的表达。慢病毒转染后使用荧光显微镜以及RT-PCR验证转染效率。对转染后的BMSCs进行成骨诱导,检测其增殖曲线、ALP活力及分泌情况,茜素红染色观察钙结节形成情况。RT-PCR检测成骨相关基因OPN、Runx 2的表达情况。（3）沉默YAP对PI3K通路的影响:YAP慢病毒转染沉默BMSCs后检测各组细胞磷酸化PI3K、Akt、m TOR蛋白的表达情况,观察YAP蛋白对PI3K通路的影响,同时我们在YAP沉默的基础上添加PI3K选择性抑制剂,阻断PI3K通路,研究YAP是否是通过PI3K/Akt/m TOR通路调节BMSCs的成骨能力。结果:（1）T2DOP大鼠骨密度降低明显,骨小梁厚度及数量、骨体积分数等骨微结构数值也都明显降低,HE染色结果也显示骨量的减少;空腹血糖以及胰岛素增加,胰岛素指数下降,证明成功建立T2DOP大鼠模型。（2）原代培养两组细胞的形态、姬姆萨染色及表面抗原结果均符合BMSCs的特征。成骨和成脂诱导后均见钙结节和脂滴形成,证明BMSCs具有多向分化能力。（3）两组BMSCs成骨能力检测:T2DOP组的BMSCs钙结节形成数量少;ALP染色深染颗粒数量少;ALP活力降低。成骨相关基因OPN、Runx2的表达水平降低。（4）T2DOP组BMSCs的YAP蛋白动态监测结果显示YAP蛋白表达增加。（5）沉默YAP基因后T2DOP组BMSCs的钙结节形成相比于T2DOP组增加,OPN,Runx2基因的表达明显恢复,ALP深染颗粒数量和ALP活力也部分提高。（6）沉默YAP后PI3K/Akt/m TOR通路检测:T2DOP组的BMSCs中PI3K/Akt/m TOR通路蛋白表达明显降低,YAP基因敲除后,PI3K/Akt/m TOR通路蛋白表达增加。（7）向沉默YAP的T2DOP组BMSCs中添加PI3K抑制剂后ALP活力下降,OPN、Runx2的表达水平降低。结论:（1）T2DOP模型大鼠的BMSCs增殖能力增强,成骨能力降低,成脂能力升高。（2）T2DOP组的BMSCs中Hippo-YAP信号通路被激活。（3）沉默的YAP蛋白可以部分提高T2DOP组BMSCs的成骨分化能力。（4）T2DOP组的BMSCs中PI3K/Akt/m TOR通路被抑制。（5）沉默YAP蛋白后能够激活被T2DOP抑制的PI3K/Akt/m TOR通路并提高BMSCs的成骨分化能力。（6）PI3K抑制剂能反转沉默YAP所提升的BMSCs的成骨分化能力。