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研究背景与目的肺表面活性物质(pulmonary surfactant)是主要由肺泡Ⅱ型细胞合成,组装并分泌的一种脂蛋白复合物,主要作用为降低肺泡表面张力,提高肺的顺应性,促进肺泡气体交换并防止肺损伤。其主要功能成分为肺泡表面蛋白(surfactant protein,SP)和脂类。其中SP-B是必需的蛋白质,不正常的SP-B表达与多种肺部疾病相关。SP-B等位基因具有多态性,基因突变除点突变(外显子和内显子),并有包含一段序列的结构区域的插入和缺失突变,这些突变与成熟SP-B的减少有关和/或影响了proSP-B的加工过程进而造成SP-B蛋白合成障碍。SP-B基因内含子4区的前半部分存在11个以不同长度的(CA)。为特征的模体(motif),每个模体由一段20个碱基左右的保守序列和随后的CA重复序列(2到17个)构成。1995年本实验室研究发现此区域序列的基因多态性同ARDS有关。2005年本实验室研究又发现(CA)。模体的缺失变异同SP-B mRNA不完全剪切有关,且此不完全剪切同肺癌相关。显示SP-B基因内含子4区(CA)。模体可能通过影响SP-B mRNA的剪切过程从而导致成熟SP-B mRNA的减少并影响功能性SP-B蛋白的表达。但这11个(CA)。模体的具体作用方式及作用机制并不清楚。RNA剪切(RNA splicing)是真核基因表达中一个重要的转录后调控过程。RNA序列决定了剪切位点,正确的剪切有赖于剪切位点的正确供给。另外剪切调控蛋白可结合到称为外显子／内含子剪切增强子(ESE或者ISE, exonic/intronic splicing enhancer)或者外显子／内含子剪切沉默子(ESS或者ISS, exonic/intronic splicing silencer)的特殊RNA序列,前者增强附近的剪切位点的剪切,后者正好相反。同时,RNA构像即RNA二级结构的变化及稳定性也会影响剪切位点的供给及增强子／沉默子序列的结合能力。基于RNA剪切的发生过程和影响因素,为进一步探讨(CA)。模体对SP-BmRNA剪切过程的影响机制,我们对SP-B基因内含子4区(CA)。模体进行了系统性研究。首先合成野生型SP-B基因内含子4区(WT intron4)基因序列,并以此为基础构建了一系列(CA)。结构域的缺失结构的质粒,然后在细胞中表达这些DNA质粒。利用Northern杂交和实时定量PCR检测(CA)。模体对SP-B mRNA剪切的影响；然后对这一系列缺失结构进行剪切位点预测及RNA二级结构分析；最后通过凝胶阻滞迁移实验(EMSA)研究相关(CA)。模体的RNA序列与其潜在结合蛋白的相互作用,探讨相关(CA)。模体影响SP-B基因剪切的发生机制。方法第一部分：合成含正常(CA)。模体的野生型SP-B基因内含子4区(WT intron4)结构,并以此为基础构建了一系列不同(CA)。模体缺失的内含子4区缺失结构(DC-A, DC-B,...DC-K),并将所有内含子4区结构导入我们构建的已经去除内含子4区的pcDNA3.1SP-B Minigene-del-m (Del-M)中,形成一系列含不同(CA)n模体缺失的SP-B Minigene,将他们转染至CHO细胞中并抽提RNA,利用Northern杂交和实时定量PCR检测mRNA的剪切效率(完全剪切/不完全剪切)分析(CA)n模体对SP-B mRNA剪切的影响。根据结果构建含特定模体的SPB minigene再次进行Northern杂交和RT-PCR以确定特定模体的对剪切的影响。第二部分：利用程序对这一系列缺失结构进行相关剪切位点的预测及RNA二级结构分析(包括分析结构的构型特征和稳定性),对含有特定模体的缺失结构进行比较分析。第三部分：分析特定(CA)。模体可能存在的潜在RNA结合蛋白并合成含有特定蛋白结合位点的RNA序列的探针及突变序列探针,用凝胶阻滞迁移(EMSA)技术研究相关(CA)。模体的RNA序列与其潜在结合蛋白的相互作用。结果第一部分：缺失结构及含特定模体结构的northern blot和RT-PCR分析：1)所有不同(CA)n模体缺失的SP-B Minigene的mRNA剪切效率较之完全(正常)剪切均有下降；2)这些含不同(CA)n模体缺失的SP-B Minigene的剪切效率各不相同,其中第8,9号(CA)。模体显示对剪切产生明显的并且相反的影响作用。第二部分：剪切位点的预测：支点序列与3’端的AG决定区的距离为258bp,共有四组高预测剪切蛋白存在于intron4模体区,HnRNP L顷向与较长(CA)n结合,模体8可能具有SRP20的特异性结合位点。RNA二级结构分析：SP-BMinigene的RNA二级结构呈现出共同的特征：1)所有的(CA)。模体或(CA)。簇团倾向于通过他们自身或和其他(CA)。模体一起形成稳定的环状结构(loop),同时(CA)。模体的保守序列倾向于形成稳定性各不相同的茎状结构(stem)。RNA二级结构稳定性或者茎状结构和/或环状结构的稳定性的变化可能同RNA剪切效率的变化相关。2)当RNA二级结构的影响因素相同时,RNA剪切效率的变化同增强子或沉默子序列的变化有关。第三部分：特定(CA)。模体存在的潜在RNA结合蛋白分析：(CA)n模体可能存在影响RNA剪切的增强子和沉默子,第8号(CA)。模体的保守序列上存在SRP20的特定结合位点,它可能通过发挥增强子的作用从而影响RNA的剪切。结论SP-B内含子4区(CA)。模体区可能存在影响RNA剪切的增强子和沉默子,第8,9号(CA)。模体显示出对剪切产生明显的并且相反(增强和抑制)的影响作用。第8号(CA)。模体的保守序列上存在SRP20的结合位点,它可能通过发挥增强子的作用从而影响RNA的剪切。在对缺失结构进行剪切效率分析时,RNA二级结构也是重要的影响因素。