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研究背景皮肤鳞癌是人体最常见的皮肤恶性肿瘤之一,发病率仅次于基底细胞癌。紫外线,尤其UVB,是诱发皮肤鳞癌的主要原因。近年来,由于大气臭氧层破坏日益严重,皮肤鳞癌发病率逐年增加。目前,皮肤鳞癌确切的发病机制尚不清楚。因此,探索皮肤鳞癌的发病机制,寻找更有效的治疗靶点为皮肤鳞癌的治疗提供新思路具有重要意义。miRNA是真核细胞进化保守的非编码小分子RNA,通过对靶基因的转录后调控在体内广泛参与了多种细胞进程。miRNA对辐射损伤及辐射相关肿瘤等疾病的调控功能是我们课题组的主要研究方向之一。前期研究工作发现miR-365对UVB辐照最为敏感,且人角质形成细胞HaCaT细胞中高表达miR-365可诱导裸鼠皮下肿瘤的生成,提示miR-365在皮肤鳞癌中作为“onco-miR”进行调控作用。本研究旨在通过预测并验证miR-365的靶基因,明确该靶基因在皮肤鳞癌发生发展过程中的作用,进一步探索miR-365通过调控该靶基因促进皮肤鳞癌发生发展的分子机制,为治疗皮肤鳞癌开发新的药物或疗法提供了新的可能和研究基础。方法①生物信息学预测miR-365的靶基因并用荧光素酶实验验证miR-365对HOXA9的靶向作用,用qPCR和western blot检测皮肤鳞癌临床肿瘤样本以及肿瘤细胞系中HOXA9 mRNA和蛋白水平的表达情况。②采用CCK-8、transwell、流式细胞术等方法,检测HOXA9上调或下调后A431细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡,并建立裸鼠肿瘤模型监测肿瘤的生长情况。③采用转录组测序对下调HOXA9后转录组表达变化进行分析,寻找HOXA9的下游靶基因并用qPCR和western blot验证其mRNA和蛋白水平的表达情况。④采用seahorse细胞外代谢检测平台检测上调或下调HOXA9后细胞代谢方式的改变;通过18F-FDG PET/CT观察裸鼠肿瘤18F-FDG的摄取情况。⑤采用ChIP-PCR、EMSA检测HOXA9与糖酵解相关基因的结合情况。⑥采用Co-IP找出与HOXA9相互作用的蛋白并用western blot、transwell等实验进行验证。结果①通过TargetScan等生物信息学网站预测miR-365的靶基因HOXA9,并经荧光素酶实验验证二者的靶向关系。HOXA9在皮肤鳞癌临床肿瘤样本以及肿瘤细胞系中呈低表达。②下调HOXA9,A431增殖加快,侵袭和迁移细胞数目增多,细胞凋亡减少。③转录组测序显示下调HOXA9可促进糖酵解相关基因的表达,并在A431细胞以及裸鼠实验中进行HOXA9上调和下调后的验证。④下调HOXA9后A431细胞OCR减少,ECAR增加;上调HOXA9后A431细胞OCR增加ECAR减少。下调HOXA9的裸鼠肿瘤对18F-FDG的摄取明显高于对照组,上调HOXA9的裸鼠肿瘤对18F-FDG的摄取低于对照组。⑤HOXA9与糖酵解相关基因的启动子区域结合。⑥CRIP2与HOXA9直接作用抑制糖酵解途径。结论miR-365的靶基因HOXA9通过调控糖酵解通路从而抑制皮肤鳞癌的生长。