关节软骨在关节运动中发挥减小摩擦、缓冲震动的作用,关节软骨被破坏,不能发挥正常功能,是各类关节疾病的主要病因。如何修复缺损软骨、恢复软骨功能,是各类关节疾病治疗的重点。现行的有关软骨缺损修复方法主要有自体异体软骨移植、髁突关节置换、组织工程软骨技术等方法,其中以组织工程软骨技术最具前景。组织工程技术是选用合适的种子细胞,结合对应的支架材料,在一定生长因子的作用下,并给予合适的生物微环境,促使种子细胞在支架材料中形成相应的组织。现行组织工程软骨技术选用的种子细胞主要有软骨细胞和干细胞两类,而软骨细胞因来源有限,其在临床应用受到了限制;干细胞来源广泛,尤其是骨髓间充质干细胞,取材方便,增殖能力强,在组织工程软骨的研究中应用比较广泛。富血小板纤维蛋白是近年来出现的血浆提取物,其富含各种生长因子,同时自体富血小板纤维蛋白克服了其他支架材料生物相容性差的问题,在临床和科研的应用中具有无可比拟的优势。本课题组在前期研究中针对组织工程软骨技术进行了大量的研究,我们选择骨髓间充质干细胞(bonemarrowmesenchymalstemcells,bmscs)作为种子细胞,富血小板纤维蛋白(platelet-richfibrin,prf)作为支架材料,构建bmscs/prf双膜结构并成功在体外合成了软骨,同时为模拟软骨在体内的受力环境,我们自行研制了一种新型细胞压力加载系统,通过在体外给予bmscs/prf双膜结构一定压力刺激,我们发现,压力对bmscs/prf双膜结构合成软骨有促进作用。同时,在体外对压力促进双膜结构合成软骨机制的相关研究中,我们发现nf-κb信号通路发挥着重要的作用,但在体内软骨缺损的修复过程中是否发挥作用,还有待于进一步研究。再者,组织工程软骨应用种子细胞和支架材料合成的软骨与正常软骨的生物力学性能之间存在差异,常导致移植物与缺损区接触面的应力集中,影响组织工程软骨功能的发挥。缺损区新生软骨必须具有正常软骨的生物力学性能,才能更好的发挥功能。bmscs/prf双膜结构在体内软骨缺损区形成的新生软骨,其生物力学特性如何,与正常软骨是否存在差异,对缺损区软骨修复很有意义,直接决定着新生软骨功能的发挥。本实验通过构建动物体内软骨缺损模型,用压力预调bmscs/prf双膜结构填充缺损区,用nf-κb抑制剂pdtc阻断双膜结构中nf-κb信号通路,通过观察缺损区软骨修复情况及nf-κb信号分子和相关成软骨基因的表达,探讨nf-κb信号通路在体内压力促进bmscs/prf双膜结构修复软骨缺损中的作用。本实验还通过检测缺损区新生软骨的弹性模量,对比新生软骨和正常软骨弹性模量的差异,评价新生软骨的生物力学特性恢复情况。实验分为三部分:实验一:通过抽取兔骨髓,分离培养骨髓间充质干细胞,经成骨成脂诱导及表面标志物鉴定,证明我们分离培养的细胞是间充质来源的干细胞,并通过抽取兔耳缘动脉血,制作prf膜片,成功构建了bmscs/prf双膜结构。对nf-κb信号通路抑制剂pdtc进行浓度筛选,证明20μmol/l的pdtc既能有效阻断信号通路,又能保持细胞膜片的活性。通过构建兔髁突软骨缺损动物模型,用bmscs/prf双膜结构(经压力预调或nf-κb信号通路抑制剂pdtc处理)填充缺损区,经切片染色,观察缺损区修复效果,评价nf-κb信号通路在双膜结构体内成软骨中的作用。常规he染色结果显示:压力预调的双膜结构填充组修复效果优于未经压力预调的双膜结构填充组,前者又以填充后8周时的软骨再生修复效果最好,接近于假手术组;nf-κb抑制剂预处理后,双膜结构填充组和压力预调的双膜结构填充组修复效果均明显降低,且两者之间没有明显差异。甲苯胺蓝染色、番红o快绿染色则从软骨细胞数量、软骨基质合成等角度,评价缺损修复效果,其结果与he染色结果一致。组织学观察结果证明了对种子细胞的压力预调能够促进双膜结构修复软骨缺损,而阻断nf-κb信号通路以后,压力预调对双膜结构修复缺损的辅助增强效果则明显降低。实验二:通过westernblotting和pcr检测缺损区nf-κb信号分子i-κb和p-65及相关成软骨基因aggrecan、sox-9、col-ll。结果显示:经加压处理的双膜结构填充组,i-κb和p-65磷酸化水平及基因表达量高于未经加压处理的双膜结构填充组;经pdtc处理后,压力预调双膜结构组和单纯双膜结构组在缺损区i-κb和p-65的磷酸化水平及基因表达量明显降低且两组间未见明显差异。westernblotting和pcr检测缺损区软骨基因aggrecan、sox-9基因表达量在各组间的变化趋势与nf-κb信号分子变化趋势相似:压力预处理双膜结构组和单纯双膜结构组的成软骨基因表达量明显高于对照,其中前者又显著高于后者;经pdtc阻断nf-κb信号通路后,单纯双膜结构移植组与静压力预处理的双膜结构移植组的再生软骨形成量均较未经pdtc处理的组明显降低。westernblotting和pcr检测结果从分子生物学角度证明了压力预调能够促进双膜结构体内合成软骨,同时nf-κb在压力促进双膜结构体内合成软骨的过程中发挥着重要的作用。实验三:通过力学加载测试系统,对比分析缺损区新生软骨的生物力学特性。我们通过以恒定移动速度在新生软骨区加压,检测记录压头在移动中的受力,通过计算统计,绘制每组标本的应力-应变曲线,计算出每组标本的弹性模量,通过对比各组标本的不同弹性模量,评价各组再生软骨的生物力学特性。结果显示,随着时间延长,各组标本弹性模量均呈上升趋势;压力预调双膜结构组在8周时,与正常软骨弹性模量最接近;压力预处理组弹性模量高于未经压力预处理的单纯双膜结构组,nf-κb抑制剂干预后,各组再生软骨的弹性模量明显降低,以压力预调双膜结构组下降最明显。从以上实验结果可知:对比压力预调双膜结构填充组和单纯双膜结构填充组,压力预调双膜结构组修复效果明显好于单纯双膜结构组,说明压力对双膜结构体内成软骨作用具有促进作用;对比双膜结构填充组和nf-κb抑制剂预处理双膜结构填充组,前者的软骨缺损修复效果明显好于后者,说明NF-κB信号通路参与了体内双膜结构促软骨再生修复的作用;对比压力预调双膜结构填充组和抑制剂预处理加压力预调双膜结构填充组可知,经PDTC阻断NF-κB信号通路后,压力的促软骨再生效应受到明显的抑制,说明压力预调促进BMSCs/PRF双膜结构再生修复缺损软骨的过程中,NF-κB信号通路发挥着重要的作用。实验结论:1、BMSCs/PRF所构建的双膜结构是一种理想的髁突软骨缺损的组织工程移植物,NF-κB信号通路参与了体内基于BMSCs/PRF双膜结构的软骨再生修复过程。2、压力预调对基于BMSCs/PRF双膜结构的髁突软骨缺损再生修复过程具有明显的促进作用,可从软骨细胞数量、软骨基质含量、与余留软骨的整合、再生软骨的生物力学性能等多方面显著提高再生软骨的质与量。NF-κB信号通路在上述压力预调促在体髁突软骨软骨再生修复过程中起到重要作用。