鼠伤寒沙门菌是一种重要的人兽共患病原菌,特别在欧美等发达国家几乎每年都有散在暴发的报道。鼠伤寒沙门菌来源广泛,可在人和动物之间通过食物链发生交叉感染。抗菌药物的使用是防治沙门菌病的重要措施,但由于其不合理使用导致耐药菌株不断出现,耐药性不断增强,并出现多重耐药的现象。此外,耐药基因的传播也是耐药菌株不断出现的原因之一。耐药基因通常位于可移动元件上,携带耐药决定因子的质粒是传播耐药性的重要因素。由此带来的耐药问题、食品安全问题也越来越严重。而目前国内关于鼠伤寒沙门菌耐药分布情况及其质粒介导耐药基因的研究相对较少。本研究以330株鼠伤寒沙门菌为研究对象,通过测定这些菌株对18种抗菌药物的最小抑菌浓度,分析不同来源的鼠伤寒沙门菌耐药特性和多重耐药状况;调查质粒介导的喹诺酮类药物耐药基因(PMQR)在鼠伤寒沙门菌中的流行和分布情况;通过质粒接合试验获得新型多粘菌素耐药基因mcr-1阳性接合子,并对供受体菌及接合子进行氨基糖苷类、喹诺酮类、苯丙醇类、β-内酰胺类、磺胺类、硝基呋喃类、喹噁啉类、四环素类药物的敏感性试验,测定其对各种抗菌药物的影响。本研究将有助于进一步了解鼠伤寒沙门菌分离株耐药流行状况、耐药特点及其质粒介导耐药基因的分布。1不同来源鼠伤寒沙门菌分离株耐药性测定与分析本研究对330株不同来源的鼠伤寒沙门菌最小抑菌浓度(MIC)进行测定,结果显示其对阿莫西林/克拉维酸的耐药率最高,达到75.8%,其次为四环素(73.9%)、氨苄西林(73.6%);对链霉素、氯霉素、头孢唑啉、萘啶酸、复方新诺明和多粘菌素E的耐药率均在50%以上;对氨曲南、卡那霉素、庆大霉素、恩诺沙星和喹乙醇的耐药率分布在20.1%-38.8%之间;环丙沙星和呋喃妥因的体外抑菌效果较好,耐药率均未达到10%;而美罗培南和阿米卡星的体外抑菌效果最好,几乎没有耐药菌株出现。鼠伤寒沙门菌分离株主要来源于养殖环节(猪场)、屠宰环节(屠宰场)、市场环节(农贸市场)和人,因此对各个环节鼠伤寒沙门菌耐药性进行研究。结果显示不同环节的鼠伤寒沙门菌对阿莫西林/克拉维酸、四环素、氨苄西林、氯霉素、卡那霉素、环丙沙星、阿米卡星、美罗培南和呋喃妥因的耐药性相似。而对余下的8种抗菌药物,其耐药性表现差异较大。对于同一个环节而言,鼠伤寒沙门菌对各抗菌药物的耐药性与本研究中菌株的总体耐药情况较为相似,其中养殖环节中鼠伤寒沙门菌的耐药率较其他三个环节都高,其次是市场环节,屠宰环节菌株的耐药率与人源菌株较为相似。鼠伤寒沙门菌多重耐药现象较为普遍。其中有260株分离株对3类及以上抗菌药物表现出耐药性,多重耐药率达83.9%(260/310)。多重耐药的优势表型为氨苄西林-阿莫西林/克拉维酸-链霉素-四环素-复方新诺明-氯霉素-多粘菌素E。市场销售环节中鼠伤寒沙门菌多重耐药现象最为严重(100%),养殖和人环节次之,多重耐药率分别为99.0%和76.1%,屠宰环节多重耐药率最低为72.3%。对2014-2016年间在定点猪场收集的鼠伤寒沙门菌进行耐药性监测发现,定点猪场鼠伤寒沙门菌对各抗菌药物的MICmin、MIC50值要普遍高于本研究中鼠伤寒沙门菌总体统计状况,说明该定点猪场中鼠伤寒沙门菌在这段时间耐药现象较为严重。2鼠伤寒沙门菌分离株中PMQR基因的流行和分布情况本研究对330株不同源鼠伤寒沙门菌中PMQR基因进行检测,PMQR基因的阳性率高达51.2%。在所有的PMQR基因中,oqxAB阳性率最高,为29.7%;aac(6-Ib-cr和qnrS的阳性率次之(19.4%和10.9%),未检测到qnrM、qnrC和qnrD基因。oqxAB的阳性率显著高于其它PMQR基因,尤其是在猪源分离株中。通过对qnr基因阳性菌株进行测序,确定了其基因亚型。在本研究中,共测出qnrB基因亚型2种,分别为qnrB4和qnrB26;qnrS基因亚型也为2种,分别为qnrS1和qnrS2。双阳性的菌株中qnrS+aac(6’)-Ib-cr和oqxAB+aac(6’)-Ib-cr共同存在的现象最为常见,分别占9.6%和9.9%。对PMQR阳性菌株的基因型和表型相关性分析显示:对喹诺酮类药物耐药的鼠伤寒沙门菌中,携带有PMQR基因的菌株占73.6%;几乎所有携带PMQR基因的表型敏感性菌株对环丙沙星敏感性下降(DCS,decreased ciprofloxacin susceptibility),所对应的MIC值的范围在0.12-1 μg/mL之间。oqxAB阳性菌株对喹乙醇的MIC值结果显示,有90.0%的oqxAB阳性菌株对喹乙醇表现耐药或者中介,88.6%的oqxAB阴性菌株对喹乙醇表现敏感或者中介,说明330株鼠伤寒沙门菌的基因型与喹乙醇的耐药表型基本对应。3鼠伤寒沙门菌质粒介导的新型多粘菌素耐药基因mcr-1的初步研究应用PCR方法对新型质粒介导的多粘菌素耐药基因mcr-1进行检测,发现330株鼠伤寒沙门菌中,仅一株菌含有此基因。通过对该mcr-1阳性菌株的全基因组测序结果进行分析,发现该鼠伤寒沙门菌全长5,232,290 bp,GC含量为51.4%,多位点序列型为ST34。进一步研究发现,该菌基因组中含有IncHI2、IncX1、IncI2、IncHI2A和IncQ1共5个复制子,提示其可能携带不止一个质粒,且mcr-1基因位于其中一个质粒上;通过质粒接合试验,获得1株mcr-1阳性接合子。药物敏感性试验结果显示,该接合子对多粘菌素E和链霉素表现耐药,所对应的MIC值分别为8 μg/mL和64 μg/mL,与受体菌相比,分别升高了 16倍和64倍。接合子对环丙沙星、恩诺沙星和萘啶酸的敏感性出现不同程度降低,与受体菌相比,接合子MIC值分别升高16、8和8倍。这表明质粒在进行接合转移时,除了介导产生多粘菌素E的耐药性外,质粒上还包含了链霉素的耐药基因,与mcr-1基因一同发生了转移,因此接合子表现出对这两种药物的耐药性。