【摘 要】
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大黄鱼(Larimichthys crocea)是我国重要的海洋经济鱼类,也是我国产量最高的海水养殖鱼类。近年来随着大黄鱼养殖规模不断扩大和养殖环境的恶化,病毒性疾病和细菌性疾病频发,给大黄鱼造成了重大经济损失,病害问题已经成为制约大黄鱼养殖业健康快速发展的瓶颈。因此,开展大黄鱼免疫功能基因的研究,将为其病害的免疫防治提供理论依据。干扰素调节因子(Interferon regulatory fac
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大黄鱼(Larimichthys crocea)是我国重要的海洋经济鱼类,也是我国产量最高的海水养殖鱼类。近年来随着大黄鱼养殖规模不断扩大和养殖环境的恶化,病毒性疾病和细菌性疾病频发,给大黄鱼造成了重大经济损失,病害问题已经成为制约大黄鱼养殖业健康快速发展的瓶颈。因此,开展大黄鱼免疫功能基因的研究,将为其病害的免疫防治提供理论依据。干扰素调节因子(Interferon regulatory factor,IRF)是一类调控干扰素基因表达的转录因子,参与机体的抗病毒免疫、细胞周期和细胞凋亡等生物学过程。本论文以大黄鱼为研究对象,解析大黄鱼IRF1、IRF2和IRF11的分子特征,探究其在调控I型干扰素表达和抗病毒免疫过程中的功能。大黄鱼IRF1、IRF2和IRF11的开放阅读框全长分别为900、957和795个核苷酸,分别编码299、318和264个氨基酸组成的蛋白质。大黄鱼IRF1、IRF2和IRF11都属于IRF1子家族,具有相似的结构特征,氨基端含有1个DNA识别结构域(DNA binding domain,DBD),在DBD结构域中具有6个保守的色氨酸;羧基端含有IRF相关结构域(IRF association domain,IAD)。同源比对及进化分析表明,大黄鱼IRF1、IRF2和IRF11和其相应的同源基因聚成一枝,与鮸鱼亲缘关系最近,且与其他物种的氨基酸序列相似度较高,分别为33.84%-95.65%、48.15%-92.16%和47.94%-97.35%。大黄鱼IRF1、IRF2和IRF11基因在所有检测的组织或器官中均有表达,Lc IRF1和Lc IRF2在血液中表达水平最高,而Lc IRF11在肌肉和皮肤中表达水平最高,三种基因在脑中表达水平都很低。在poly(I:C)刺激后,头肾和鰓组织中,Lc IRF1、Lc IRF2和Lc IRF11的表达水平于刺激后6 h达到最高,在头肾中分别是对照组的31.78倍、17.03倍和13.80倍,在鰓中分别是对照组的29.96倍、12.73倍和1.85倍;脾脏中,Lc IRF1基因的表达水平也是在6 h达到最大,是对照组的5.21倍,Lc IRF2和Lc IRF11基因表达水平分别于刺激后3 h和48 h达到峰值,其中Lc IRF2增加3.05和6.08倍,Lc IRF11增加16.87和75.63倍。这些结果表明Lc IRF1、Lc IRF2和Lc IRF11可能参与大黄鱼抗病毒免疫应答。构建了大黄鱼IRF1、IRF2和IRF11真核表达载体,分别电转大黄鱼头肾细胞系(LYCK),结果显示,过表达Lc IRF1和Lc IRF2蛋白均能够诱导Lc IFNd和Lc IFNh基因的表达,且过表达Lc IRF2蛋白显著下调Lc IFNc基因的表达;过表达Lc IRF11蛋白能够诱导Lc IFNc、Lc IFNd和Lc IFNh基因的表达。荧光素酶报告基因实验也取得了类似的结果,大黄鱼IRF1和IRF2能够增强Lc IFNd和Lc IFNh基因启动子的转录活性,且Lc IRF2能够下调Lc IFNc启动子的活性。Lc IRF11能够上调Lc IFNc、Lc IFNd和Lc IFNh基因启动子的转录活性。重组Lc IFNc、Lc IFNd及Lc IFNh均可促进大黄鱼头肾细胞(HKLs)中Lc IRF1、Lc IRF2和Lc IRF11表达,但Lc IRF2在Lc IFNh刺激6h时显著下调,Lc IRF11在Lc IFNc及Lc IFNh刺激6h和Lc IFNd刺激12h时也显著下调。抗病毒实验结果显示,大黄鱼IRF1、IRF2和IRF11过表达均显著抑制SVCV病毒的糖蛋白(Glycoprotein,G)、基质蛋白(Matrix protein,M)和磷酸蛋白(Phosphoprotein,P)基因转录,病毒滴度分别下降了10000倍、316228倍和38459倍。这些结果表明,大黄鱼IRF1、IRF2和IRF11通过调节Lc IFNc、Lc IFNd和Lc IFNh基因的表达,增强大黄鱼的抗病毒免疫反应。
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