研究背景：胆囊癌是一种少见、致死率高的疾病,是肝外胆道最常见的恶性肿瘤,发病率居消化道恶性肿瘤第7位。胆囊癌侵袭性高,预后较差,所有分期的胆囊癌患者5年生存率约为5%,大部分患者死于1年之内。虽然胆囊癌并不常见,但在某些地域的发病率很高,智利的胆囊癌死亡率是世界最高的,中国和印度中北部地区的发病率也在逐年上升。因此,研究胆囊癌的生物学行为变得非常重要,在没有可靠的治愈方案时,寻求药物预防或者药物治疗方案是非常必要的。天然药品是新药研究的重要来源之一,由于不同的生物学效应,环状三萜如熊果酸和贝母在抗癌新药研究领域备受关注。茯苓酸(PA)是来自于茯苓的一种三萜类化合物,除了茯苓之外也存在于其它的真菌。PA具有止吐、消炎和抗肿瘤的作用。最近许多研究发现,PA可以抑制不同种类的肿瘤的生长、侵袭和转移,包括前列腺癌、肺癌、乳腺癌和胰腺癌。但是目前还没有PA对胆囊癌抑制作用的研究,本研究中我们将关注PA对胆囊癌细胞的抑制作用及其可能的作用机制。研究目的：本研究的目的是评估PA对人胆囊癌细胞GBC-SD的生长、迁移、侵袭和转移、黏附能力的影响,其对细胞生长周期的影响,评估其作用效应是否有剂量和时间依赖性。探讨PA对人胆囊癌细胞抑制作用的可能机制。在动物实验中检测PA能否抑制裸鼠GBC-SD种植瘤的生长,初步评估PA是否能够作为抑制胆囊癌的备选药物以进行下一步的研究。研究方法：细胞培养和处理：将人胆囊癌细胞GBC-SD培养于添加10%胎牛血清的DMEM培养基中,在细胞培养箱中37℃、5% CO2环境下培养,细胞处于对数生长期后进行各种检测。PA在0.1%DMSO中重悬后以20 mMol/L的浓度保存,之后稀释为工作剂量用于之后的各项检查,对照组则使用0.1%DMSO溶液。实验组中分别加入浓度为10μg/ml,20μg/ml和50μg/ml的PA,分别在作用12h、24h和48 h后进行后续的检测。细胞增殖活性检测：在3个实验组和对照组的肿瘤细胞添加药物分别作用12h、24 h和48 h后,使用细胞计数试剂盒kit-8评价PA对GBC-SD的抗增殖作用。根据试剂盒的说明要求处理后,将10μl的CCK-8溶液加入到含有肿瘤细胞的各个孔板中,孵育之后在450nm吸光度值下,使用酶标仪进行测定。细胞周期测定：将处理后的肿瘤细胞使用胰蛋白酶消化后收集,在试管中使用1ml 80%的冰乙醇固定并在4℃下孵育15分钟。温育后,在1500转离心5分钟,使用含300μg/ml RNA酶的碘化丙啶500μl(10μg/ml)重悬沉淀。然后将细胞在冰上孵育30分钟,并用53μm尼龙网过滤。细胞周期分析使用FACS Calibur流式细胞仪,采用ModFit LTTM软件计算处于各细胞周期的肿瘤细胞数目。Western blot分析：各组中的蛋白均用RIPA缓冲液制备,每个样品(30μg)采用SDS-聚丙烯酰胺(10%)凝胶电泳后转印到PVDF膜上。抗体封闭之后,将膜与一抗在4°C下封闭过夜,之后与二抗一起孵育。之后将膜与ECL Plus试剂一起转印到X光胶片中。所用的试剂剂量分别为总Akt (1:1000), pAkt (1:1000),总ERK1/2 (1:1000), pERK1/2 (1:1000), GAPDH (1:1500), PCNA (1:10000), ICAM-1 (1:200)和RhoA(1:1000)。迁移和侵袭实验：各组中取同样数目的肿瘤细胞(1×105)与含1%胎牛血清的0.5 ml DMEM混合加入Transwell上部隔室,并保持在37℃下16小时。作为化学引诱物,下部隔室内置入含10%胎牛血清的DMEM溶液。孵育之后,将过滤器上表面的细胞使用棉棒擦去,下表面的细胞使用结晶紫染色。在光学显微镜下,随机选择10个区域进行迁移细胞数目的计数,计算迁移细胞的平均数目。侵袭实验的做法是使用BioCoat基质胶侵袭小室代替Transwell中的过滤器。之后的操作与迁移实验相同。三组细胞各进行3次试验,取其平均值。细胞黏附实验：12孔板在涂覆纤连蛋白后于4℃下过夜,第二天使用PBS液洗涤后预热到37℃。残余的结合位点使用含1%胎牛血清的PBS液阻断1小时,加入GBS-SD细胞后孵育1小时,用Percoll密度浮选介质分选后固定剂处理15分钟,PBS洗涤后用0.5%结晶紫染色处理,再次洗涤,并使其干燥,然后计数细胞。统计每高倍镜视野下的平均细胞数并比较各组之间的差异。动物实验：选取4-5周龄的BALB/c (nu/nu)雄性裸鼠,收集处于对数生长期的人胆囊癌GBS-SD细胞约1×107接种于裸鼠的腹部皮下组织。待肿瘤生长到直径约1cm大小,将小鼠随机分为2组,每组15只。实验组每日使用含有2mgPA的生理盐水2 mL灌胃,对照组则使用等量生理盐水灌胃。持续给药10天,期间每日测量小鼠的肿瘤大小,绘制肿瘤生长曲线。停止给药后3天,脱颈法处死所有小鼠,解剖出小鼠腹部的肿瘤,测量肿瘤的长短径,重量,并计算PA对肿瘤的抑制率=(对照组小鼠肿瘤的平均重量一实验组小鼠肿瘤的平均重量)/对照组小鼠肿瘤的平均重量×100%,比较2组小鼠种植瘤的大小。结果：PA可以抑制胆囊癌细胞的生长：在10μg/ml的PA作用12小时后,胆囊癌细胞的生长受到抑制,而且浓度更高的PA抑制作用更明显。在10μg/ml,20μg/ml和50μg/ml的PA作用48小时之后,与对照组相比,约25%,40%和的70%胆囊癌细胞生长分别被抑制。我们使用流式细胞仪检测了细胞周期。结果发现随着作用时间延长和剂量增加,更多的细胞处于G1期,进入S期的细胞则相应减少。这说明PA的抑制增殖作用可能是通过诱导肿瘤细胞停滞于G1期,不过处于G2期和M期的细胞并没有受到相应的影响。研究结果表明PA可以抑制胆囊癌细胞的生长,其抑制作用具有时间和剂量依赖性,作用机制可能是诱导更多的肿瘤细胞停滞于G1期。PA可以抑制胆囊癌细胞迁移、侵袭和黏附能力：不同剂量的PA(10μg/ml,20 μg/ml and 50μg/ml)可以剂量依赖性的抑制胆囊癌细胞的迁移能力。我们进行了肿瘤细胞的迁移和侵袭能力实验,发现随着PA浓度增加,能够进入到下部隔室的细胞数量越来越少,结果表明PA可以显著降低胆囊癌细胞的迁移和侵袭能力。通过黏附实验,我们发现PA剂量为10μg/ml,已经可以抑制肿瘤细胞的黏附能力,固定在纤连蛋白上的肿瘤细胞数目比对照组有所减少,但差异无统计学意义(P=0.059)。当PA剂量达到20μg/ml(?)50μg/ml时,抑制作用更加明显,肿瘤细胞数目的减少有统计学意义(P<0.01)。PA可以剂量依赖性的抑制肿瘤细胞的粘附能力。PA可以抑制裸鼠皮下种植瘤的生长：处死并解剖小鼠,完整剥离小鼠腹部的肿瘤,测量肿瘤的长短径,重量,并计算PA对肿瘤的抑制率为25.6%。从给药到处死小鼠共计13天时间,每天测量并记录各小鼠的肿瘤大小,取其平均值,绘制肿瘤生长曲线,2组肿瘤大小的t检验结果提示实验组和对照组中肿瘤大小差异有统计学意义(P<0.05)。PA抑制胆囊癌细胞成瘤性的可能机制：我们通过Western-blot检测了胆囊癌细胞中许多重要蛋白质的表达。发现PA可以剂量依赖性的下调PCNA、ICAM-1、 RhoA蛋白的表达,这些蛋白能够影响肿瘤细胞的生长、侵袭和转移能力。我们还发现PA对总的Akt和ERK1/2没有影响,但可以剂量依赖性的下调磷酸化Akt和ERK1/2的表达。数据表明PA可能是通过抑制Akt和ERK1/2通路来达到抑制胆囊癌细胞的作用。结论：PA可以抑制胆囊癌细胞的生长、迁移、侵袭和转移能力,使肿瘤细胞停滞于G1期,可以抑制裸鼠皮下种植瘤的生长,可能的机制是通过抑制Akt和ERK1/2的磷酸化来抑制胆囊癌细胞。在未来的研究中,PA可以作为胆囊癌治疗的备选研究用药。