第一部分DNA聚合酶beta在ROT介导的细胞周期异常调控中的作用第一节帕金森病相关的损伤因素对SH-SY5Y细胞周期分布的影响目的观察各种PD相关的神经损伤因素对细胞周期分布的影响。方法体外培养多巴胺能细胞SH-SY5Y细胞,分别采用不同浓度的H2O2(100μM、200μM和500μM)、MPP+(1mM、2mM和4mM)和ROT (0.5μM、2μM和5μM)处理细胞,四甲基偶氮唑盐法(MTT法)检测细胞活力；进一步PI单染活细胞流式细胞术检测细胞周期分布,FITC-BrdU和PI双参数流式细胞术分析DNA复制情况及细胞周期变化。结果各种神经损伤因素处理细胞后,细胞活力呈浓度依赖性降低,200μM H2O2、2mM MPP+和2μM ROT分别处理细胞36h后引起细胞活力降低为55.6%、50.7%和52.3%。进一步对三种药物的细胞周期检测发现,H2O2和Mpp+引起的细胞处于G2/M期的比例升高不明显,而ROT在低浓度情况下0-0.25μM之间时出现G2/M期抑制,而0.5μM后随浓度升高G2/M期逐渐升高,至2μM后G2/M期改变非常明显,并能维持G2/M状态。进一步光镜下观察H2O2、MPP+和ROT引起的细胞形态变化,H202、MPP+能引起突起明显减少、胞体变扁、不透明、胞质出现凝聚现象,而正常SH-SY5Y细胞经RA诱导后,形态上似神经元有较多突起,胞体透明；而ROT引起细胞形态明显破坏,呈现不规则形,并含有细胞碎片。应用0.25μM和2μM ROT处理不同时间后细胞周期分布明显不同,0.25gM处理1.5d、3d、5d和7d,细胞周期主要阻滞在G1/S期,G2/M期变化不明显,而2μM ROT能引起细胞周期G2/M期细胞明显增多,在36h达高峰,并维持一段时间,并且DNA含量大于>4N的细胞数明显增多,进一步应用FITC-BrdU检测BrdU掺入量分析DNA复制,发现在G2/M期后细胞没有发生细胞分裂却出现再次DNA复制增加(核内复制),甚至有8倍DNA含量的细胞形成。结论ROT (2μM)能引起明显细胞周期G2/M期阻滞和核内复制,有助于探讨多巴胺神经元细胞周期异常调控以及核内复制过程。第二节DNA聚合酶beta在ROT介导的细胞周期异常调控中的作用目的探讨DNA聚合酶beta的表达在ROT介导的细胞周期异常调控中的作用。方法应用免疫印迹western blot法检测DNA聚合酶beta表达,应用抑制剂或siRNA抑制DNA聚合酶beta的表达,流式细胞术FITC-BrdU和PI双参数观察细胞周期及核内复制情况。进一步在ROT立体定向注射大鼠模型中观察DNA聚合酶beta的表达及与多巴胺神经元细胞周期的相关性。结果ROT能引起DNA聚合酶beta表达升高,而siRNA或抑制剂DDC能抑制ROT引起的DNA聚合酶beta表达,并抑制核内复制。而ROT立体定向注射SD大鼠体模型中发现受损的多巴胺能神经元细胞周期G1期标志cyclin D表达升高并胞浆中颗粒聚集,同时观察到神经元细胞周期中DNA聚合酶beta表达升高,且DNA聚合酶beta较特异的表达于中脑黑质致密部和网状部。结论DNA聚合酶beta可能是ROT介导的多巴胺能神经元细胞周期异常调控中的重要参与者。第二部分G2/M关键调控分子Cdc2在ROT介导的多巴胺能细胞损伤中的作用第一节Cdc2参与调节ROT介导的SH-SY5Y细胞周期G2/M期阻滞目的探讨Cdc2在ROT引起的细胞周期G2/M阻滞中的作用。方法应用流式细胞术PI单染活细胞检测ROT引起的细胞周期变化,免疫荧光Hoechst染色细胞核及吉姆萨(Giemsa)染色染色体变化,激光共聚焦显微镜检测Cdc2表达及其亚细胞定位,进一步免疫印迹western blot检测总Cdc2和p-Cdc2变化,以及免疫共沉淀检测总Cdc2中p-Cdc2表达；细胞周期抑制剂roscovitine和siRNA Cdc2抑制Cdc2的活性,及蛋白和RNA水平的表达,流式细胞术观察细胞周期的变化。结果经ROT不同浓度和不同时间处理细胞后,细胞活力呈浓度和时间依赖性降低,尤其是2μM ROT处理细胞36h后细胞活力减低到正常对照组的40-60%,并且胞浆和胞核中细胞凋亡分子caspase-3活化增高,尤其是在细胞浆中表达明显增高。DNA经Hoechst染色后,荧光显微镜下发现ROT引起细胞凋亡样改变,出现核皱缩和核碎裂,同时还可发现有细胞核双核或多核的存在。吉姆萨染色显示处于分裂期的细胞出现染色质的凝聚,而经ROT处理细胞却引起染色质较为分散并有核小体形成。经ROT (2μM)分别处理12h、24h、36h和48h,处于G2/M期的细胞数比例呈时间依赖性增多,在36h时G2/M期细胞比例从24.0±1.6%升高到68.9±2.5%；同时激光共聚焦显微镜观察显示,经ROT处理36h后,细胞中Cdc2在细胞浆中的表达明显增高甚至有Cdc2颗粒的聚集；进一步免疫印迹western blot法检测Cdc2总蛋白及p-Cdc2的表达发现,ROT (36h)处理细胞后Cdc2蛋白表达升高,而Cdc2/cyclin B复合体中cyclin B表达却无明显表达增高；并能发现代表Cdc2活性的p-Cdc2(Thr161)表达降低或者代表Cdc2抑制性活性的p-Cdc2(Thr14或Tyr15)表达升高；应用Cdc2抗体沉淀细胞中的Cdc2抗原, western blot检测p-Cdc2(Thr14或Tyr15)的表达,发现ROT处理细胞36h后,细胞中的Cdc2总蛋白中Cdc2活性是减低的,进一步证实ROT引起细胞中Cdc2的活性明显减低；细胞周期抑制剂roscovitine预处理细胞后,Cdc2活性减低,经ROT处理或无ROT情况下都能引起细胞处于G2/M期的细胞比例明显增高,使经ROT处理(12h)后G2/M期的细胞比例从46.7±3.1%升高到65.9±1.7%；siRNA转染细胞在RNA水平降低Cdc2的表达,并抑制ROT引起的Cdc2表达增高和抑制ROT引起的细胞周期G2/M期阻滞,使处于G2/M期的细胞比例明显降低,从67.6±2.3%降低到45.6±3.1%。结论ROT引起的G2/M期明显阻滞可能和Cdc2活性降低相关,而ROT引起的Cdc2表达升高维持G2/M阻滞状态。第二节Cdc2聚集在多巴胺能神经元凋亡中的作用目的探讨Cdc2胞浆中聚集与多巴胺能神经元凋亡的相关性。方法进行细胞总蛋白的胞浆和胞核蛋白分离及western blot检测ROT引起的天冬酰胺内肽酶-3(caspase-3)的表达；免疫荧光Hochest染色检测细胞核形态变化,流式细胞术Annexin V/PI双标检测细胞凋亡；激光共聚焦显微镜观察Cdc2与caspae-3的亚细胞定位,并western blot检测siRNA介导的Cdc2减低引起的caspase-3/-9的表达变化；分别应用Cdc2抗体和GAPDH抗体进行免疫共沉淀,观察细胞内Cdc2与GAPDH在细胞内的相互作用。结果ROT能引起活化的caspase-3明显增高,尤其是胞浆中的活化的caspase-3表达；细胞形态显示核皱缩和核碎裂代表的细胞凋亡；流式细胞术检测结果显示ROT处理细胞36h后细胞凋亡率从6.6%升高到46.8%(P<0.05)；进一步应用siRNA降低Cdc2的表达,发现细胞凋亡明显降低,凋亡率从46.8%降低到31.0%(P<0.05)；并且镜下观察到Cdc2与活化的caspase-3在胞浆中存在共定位；且Cdc2表达减低抑制caspase-3/-9表达增高；在Cdc2引起的免疫沉淀组份中能检测到GAPDH表达,而GAPDH引起的免疫沉淀组份中也能检测到Cdc2的表达。结论Cdc2聚集可能通过影响caspase-3/-9通路参与细胞凋亡过程,而Cdc2聚集可能与GAPDH相关的降解途径异常相关。第三部分ROT介导的PD小鼠模型中细胞周期分子的表达及调控目的探讨ROT灌胃PD小鼠模型中异常的细胞周期调控。方法应用羧甲基纤维素(CMC)和氯仿充分溶解ROT,选22-26g雄性C57小鼠随机分三组：正常对照组(15只),溶剂对照组(15只),ROT组(20只),ROT组灌胃0.1ml/10g (30mg/kg,1次/d x30d),检测体重变化,提前3d进行行为学(爬杆实验和悬挂实验)检测,处死小鼠后行脑组织氧化应激和脂质氧情况检测；脑组织行多聚甲醛灌流后,冰冻切片免疫荧光检测细胞周期分子E2F1、alpha-synuclein和cleaved caspase-3等表达的检测；另设干扰组腹腔注射细胞周期抑制剂roscovitine,激光共聚焦显微镜下观察roscovitine对ROT介导的多巴胺神经元损伤的影响。结果持续灌胃30d后,小鼠体重有明显减退,自主活动减弱；行为学实验结果显示,小鼠爬杆及悬挂实验ROT灌胃小鼠较正常小鼠都有明显统计学差异；中脑组织氧化应激水平检测显示经ROT灌胃后小鼠的中脑黑质组织中脂质氧化丙二醛(MDA)水平较对照组明显升高(P<0.05)；而氧化应激活性分子超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽还原酶(GSH)活性降低(P<0.05)。进一步激光共聚焦显微镜下观察发现ROT引起中脑黑质多巴胺神经元的变性死亡,神经元数目明显减少,凋亡分子caspase-3活化增加,alpha-synuclein出现细胞中聚集,细胞周期调控分子E2F1免疫活性增强；而应用细胞周期抑制剂roscovitine预处理后能明显抑制多巴胺能神经元的损伤,并抑制凋亡蛋白caspase-3的活化。结论ROT灌胃小鼠模型能较成功模拟PD某些重要病理变化过程；ROT引起多巴胺神经元细胞周期异常,而细胞周期调控异常可能参与细胞凋亡过程。