多发性骨髓瘤（Multiple myeloma，MM）是以浆细胞异常增生和分泌大量单克隆免疫球蛋白（M蛋白）或本周氏蛋白（Bence Jones蛋白，游离的单克隆性κ或λ轻链）为特征的恶性肿瘤性疾病。MM发病率约为1~2/10万，约占血液系统肿瘤的10%，全身恶性肿瘤的1%，多见于中老年。临床上主要分为IgG型、IgA型、轻链型、IgM型、IgD型和寡分泌或未分泌型，IgE型则极罕见。由于恶性浆细胞无节制地增生、广泛浸润和大量单克隆免疫球蛋白的出现及沉积，正常免疫球蛋白分泌受到抑制，从而引起溶骨性骨骼破坏、反复感染、贫血、高钙血症、肾功能不全等一系列临床表现。目前MM仍是一种不可治愈的疾病，MM临床表现多样化，起病缓慢，早期可数月至十多年无临床症状，因此早期易被误诊。筛选用于MM早期诊断和随访的敏感性标志物面临着重大的挑战，探索新的相关发病机制将会给MM的诊断、治疗以及预后带来曙光。异常糖基化与多种肿瘤细胞的恶性转化密切相关。大多数N-糖蛋白由肝脏或B淋巴细胞合成，血清中N-糖组分的改变可以反映肝脏和B淋巴细胞的生理功能变化。因此，糖基化的改变有望成为多发性骨髓瘤早期非创性诊断和鉴别诊断的依据。基于DNA测序仪的荧光糖电泳（DSA-FACE）、高效液相色谱（HPLC）、基质辅助激光解吸离子化飞行质谱（MALDI-TOF）以及凝集素微阵列（lectin microarray）等技术的发展为我们提供了快速、高灵敏和高通量的N-糖组检测手段，使血清N-糖基化的改变运用于临床诊断和治疗成为可能。本研究从大样本临床MM病例血清、IgG型MM纯化后IgG和IgG型MM的骨髓瘤细胞系异常糖基化机制及其调控研究等三个方面探讨了N-糖组分析在MM中的特征性改变、早期诊断、鉴别诊断价值和相关的致病机制。第一部分：多发性骨髓瘤血清N-糖组及唾液酸水平分析本研究从血清中糖蛋白的N-糖组学分析入手，评估N-糖谱在各型MM中的特征性改变，阐明N-糖标志物在部分型别中诊断、鉴别诊断及随访中的价值。我们采用DSA-FACE的方法，检测了292例研究对象（96例IgG型MM，41例IgA型MM，42例轻链型MM，20例IgD型MM和93例正常对照）以及缓解和复发前后随访病人的血清N-糖组图谱，比较不同类型MM其特征性N-糖谱改变，分析各峰值的差异，分别采用IgG/GB和去IgG球蛋白/GB两种方法进行标化，来揭示IgG型MM中肝脏和B淋巴细胞两种来源的糖蛋白其特征性的糖谱改变，并用ROC曲线评估了轻链型MM中特定糖型丰度的诊断和鉴别诊断效力。结果发现，IgG型MM的三个N-糖链结构（NGA2F，Peak1；NG1A2F, Peak3和NG1A2F, Peak4）升高，二个N-糖链结构（NA2, Peak5和NA3, Peak8）下降，同时随着病情的变化（复发和缓解），N-糖链的峰值呈现相应的改变；进行蛋白标化后来源于B淋巴细胞的无半乳糖二天线结构的糖型（NGA2F/(IgG/GB)%，Peak1/(IgG/GB)%和NGA2FB/(IgG/GB)%，Peak2/(IgG/GB)%）丰度明显下降，而去IgG糖蛋白三天线和四天线的糖结构丰度（NA3/[(GB-IgG)/GB]%，Peak8/[(GB-IgG)/GB]%；NA3Fb/[(GB-IgG)/GB]%，Peak9/[(GB-IgG)/GB]%；NA3Fc/[(GB-IgG)/GB]%，Peak10/[(GB-IgG)/GB]%；NA4/[(GB-IgG)/GB]%，Peak11/[(GB-IgG)/GB]%和NA4Fb/[(GB-IgG)/GB]%，Peak12/[(GB-IgG)/GB]%）明显升高。血清凝集素印迹的结果显示IgG型MM中小扁豆凝集素（Lens culinaris agglutinin，LCA）、红细胞型植物凝集素（Phytohemagglutinin-erythrocyte type，PHA-E）和山槐素白细胞凝集素（Maackiaamurensis leukoagglutinin，MAL）的水平升高。在轻链型MM中单半乳糖二天线结构（NG1A2F，Peak3）诊断的ROC曲线下面积为0.943，最佳截断值（cut off值）5.15%对应的灵敏度和特异度分别为88.1%和90.5%；同时与IgG型MM相比，Peak3鉴别诊断的ROC曲线下面积为0.895，最佳截断值6.77%对应的灵敏度和特异度分别为100%和78.6%。N-糖标志物Peak3在轻链型MM的诊断和鉴别诊断中，与常规的蛋白电泳和免疫固定电泳相比，其检测灵敏度提高明显。结论：N-糖型的改变在IgG型MM中随着其血清蛋白分布情况呈现相应的变化，其中去IgG糖蛋白的N-糖型与大多数肿瘤相似，B淋巴细胞分泌IgG的N-糖型中无半乳糖二天线结构明显降低；N-糖标志物在轻链型MM中具有较高的诊断和鉴别诊断效力，可以给轻链型MM的诊断、监测和预后判断上提供新的辅助诊断手段。各型多发性骨髓瘤血清唾液酸（sialic acid，SA）的检测结果显示，与健康对照相比，IgA型、轻链型和IgD型多发性骨髓瘤都显著升高，而IgG型多发性骨髓瘤无显著差异；用SA对IgA型、轻链型和IgD型多发性骨髓瘤进行诊断效力评估，ROC曲线下面积分别为0.873、0.760和0.845。第二部分：IgG型多发性骨髓瘤的IgG N-糖组研究本研究从血清中纯化的IgG糖型入手，利用N-糖组图谱与凝集素印迹相结合的方法来揭示IgG型多发性骨髓瘤不同疾病分期中纯化IgG的N-糖基化改变，进一步推测其可能的作用机制，同时在骨髓标本中对相关的糖基转移酶表达水平进行了验证。选取了26例IgG型多发性骨髓瘤和16例健康对照的纯化IgG样本，用DSA-FACE的方法进行了N-糖谱的分析，共检测到7个糖型；同时对24例IgG型多发性骨髓瘤和12例健康对照的纯化IgG样本进行了相关的凝集素印迹分析。研究发现，按照IgG上连接的半乳糖多少进行分类后，无半乳糖二天线结构（NGA2F，Peak1和NGA2FB,Peak2）在IgG型多发性骨髓瘤组较健康对照组明显降低，而双半乳糖二天线结构（NA2，Peak5；NA2F，Peak6和NA2FB，Peak7）却明显升高，单半乳糖二天线结构（NG1A2F，Peak3和Peak4）无显著改变。这一结果提示了在IgG型MM的N-糖型中半乳糖的表达水平升高，推测其糖基化修饰的代谢酶——β-1,4-半乳糖基转移酶1亚型（beta1,4-galactosyl transferase polypeptide1，B4GALT1）可能起了关键的作用。24例IgG型MM疾病组与12例健康对照组的凝素印迹结果显示，血清纯化IgG重链的蛋白量经考马斯亮蓝染色标化后，疾病组IgG与伴刀豆球蛋白A（concanavalin A，ConA）和红细胞型植物凝集素（phytohemagglutinin，PHA-E）的结合度下降，而与欧洲接骨木凝集素（Sambucus nigra agglutinin，SNA）的结合度上升；用ConA对IgG重链的N-糖基化水平标化后，鸡冠刺桐凝集素（Erythrina cristagalli lectin，ECL）/ConA显著升高，SNA/ConA也明显升高。为了阐明与ECL和SNA代谢密切相关的糖基转移酶B4GALT1和α-2,6唾液酸转移酶1（alpha-2,6-sialyltranferase1, ST6GAL1）的表达水平，采用7例IgG型MM和3例贫血病人（对照组）的骨髓标本进行了验证，结果表明IgG型MM的病人骨髓中B4GALT1和ST6GAL1及其相关的凝集素ECL和SNA都有升高的趋势，其中，ST6GAL1、SNA和ECL出现了显著性升高。结论：IgG异常半乳糖基化和唾液酸化作用与IgG型MM的发生发展密切相关，初步明确了IgG型MM病变过程中纯化IgG异常糖基化的存在及其病理意义和可能机制。第三部分：IgG型多发性骨髓瘤细胞异常糖基化机制及功能研究本部分的研究通过用干扰ST6GAL1和B4GALT1基因的慢病毒载体感染IgG型多发性骨髓瘤细胞系（LP-1），使ST6GAL1和B4GALT1糖基转移酶表达下降，采用实时荧光定量PCR和WB检测RNA干扰后ST6GAL1和B4GALT1的mRNA水平和蛋白水平的变化来确定RNA的干扰效果，在此基础上，利用Annexin V/PI双染法细胞凋亡实验、细胞周期实验来研究RNA干扰后IgG型多发性骨髓瘤细胞系生物学行为的改变，进一步表明α-2,6唾液酸转移酶1和β-1,4-半乳糖基转移酶1亚型在IgG型多发性骨髓瘤的发生和发展中的作用，结果表明对ST6GAL1进行RNA干扰后，LP-1细胞的早期凋亡率和晚期凋亡率明显上升，活细胞率明显下降，细胞周期停滞于G0/G1期；同时，磷酸化P38MAPK和NF-κB出现下调，磷酸化MEK1/2和SAPK/JNK（p46）出现上调。而对B4GALT1进行RNA干扰后，LP-1细胞的早期凋亡率明显下降，晚期凋亡率、活细胞率和细胞周期各期无显著差异，揭示了IgG MM中α-2,6唾液酸转移酶1抑制了细胞的凋亡，使细胞增殖能力加强，促进了IgG型多发性骨髓瘤的发生，而β-1,4-半乳糖基转移酶1亚型对细胞周期和凋亡的影响不大。综上所述，通过本项研究表明，N-糖基化及唾液酸修饰在各型MM中有其各自的特征性改变，可以作为部分型别特异性的生物标志物用于疾病的早期诊断、鉴别诊断、疗效观察和动态随访；其中，IgG型MM中半乳糖基化和唾液酸化的异常与疾病的发生和发展密切相关，尤其糖基转移酶ST6GAL1与IgG型MM细胞系的增殖、凋亡和磷酸化通路的改变关系密切，提示N-糖基化的改变可能作为一种新的致病因素来提示相对有效的治疗策略，给这种不治之症带来新的希翼。