附着胞的形成和侵染菌丝扩展是稻瘟菌（Magnaporthe oryzae）侵染循环中两个至关重要的环节,这两个侵染步骤受到Pmk1-MAPK信号通路的调控,但位于该信号通路上游的MEK激酶MST11的激活机制尚未清楚。因此,作者在本研究中详细解析了 Mst11的激活机制。首先,通过结构域分析发现,MST11 含有Sterile alpha motif（SAM domain）、Ras associate domain（RA domain）、Protein kinase domain和两个保守的磷酸化位点S453和S458。然后,通过结构域缺失实验发现:当包括RA domain和两个磷酸化位点（S453和S458）在内的结构域缺失时,稻瘟病菌无法形成附着胞,且突变体体内的Pmk1激活受到抑制;当缺失RA domain时,稻瘟病菌依旧可以形成附着胞,但致病力下降。进一步分析发现:RA domain缺失突变体在接种疏水表面48小时后有超过50%分生孢子的芽管出现了分支,并在分支顶端也形成一个附着胞,但附着胞的胞内膨压下降,因此可能导致突变体的致病力下降。外源添加环化腺苷酸cAMP可以有效抑制RA domain缺失突变体芽管的分支形成。已知Ras2是GTP结合蛋白,其中G18V的突变可以使Ras2持续激活表达。通过酵母双杂交实验发现:Ras2能与Mst11互作,尤其是持续激活的Ras2能增强与MST11的互作。由此推测:在稻瘟菌体内,激活的Ras2与Mst11结合可能是激活下游Pmk1信号通路的重要原因之一。第三,通过缺失和点突变发现:Mst11磷酸化位点S453和S458的磷酸化对于稻瘟菌附着胞的形成、Pmk1激活和致病性是必不可少的。已知Mst11在出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）中的同源物Ste11存在自我互作。通过酵母双杂交实验证实:Mst11的N端直接与kinase domain互作。进一步研究发现Mst11的kinase domain中存在激酶抑制剂结合位点DFG motif,突变DFG motif附近的S789减弱Mst11的自我互作。在野生型中表达MST11S789G能恢复mst11敲除体在附着胞形成和致病性方面的缺陷,该突变体可以在亲水表面形成附着胞,且体内Pmk1的磷酸化水平显著上升,由此证明S789G的点突变导致稻瘟病菌Pmk1信号通路的持续激活。以上结果表明:Mst11结合至激活状态的Ras2以及S453和S458磷酸化位点的磷酸化对于稻瘟病菌激酶Mst11的激活以及发挥生物学功能非常重要,且Mst11的激活和功能的发挥是通过抑制其自身N端和kinase domain间的互作而实现的。此外,Mst1 1和Ras2的结合将反馈调节cAMP信号通路,从而抑制稻瘟病菌芽管的分支以及多个附着胞的形成。作者所在本实验室在前期研究中已克隆了 MGG00106基因,并发现该敲除体致病力下降。作者在本研究中初步解析了 MGG00106基因的生物学功能。首先,经过蛋白序列比对后发现MGG00106基因为出芽酵母（S.cereisiae）中Bud7基因的同源物,因此将该基因命名为MoBud7。然后,通过表型分析发现:Mobud7敲除体致病力下降,且附着胞形成能力显著下降;进一步分析发现,外源添加cAMP分解抑制剂能恢复敲除体附着胞的形成,推断Mobud7在cAMP信号通路的上游发挥作用。同时,敲除体初生侵染菌丝形成延迟且形成率较野生型下降。已知初生侵染菌丝的形成需要成熟附着胞内累积甘油直至产生足够的膨压且糖类物质为附着胞内甘油的主要来源之一,进一步测定Mobud7敲除体附着胞的膨压和KI/I2染色后发现:Mobud7敲除体附着胞内膨压下降;在接种疏水玻片12和24小时后,野生型P131的附着胞几乎不能被KI/I2溶液染色,而敲除体形成的附着胞中能被染色的比例较野生型显著升高,因此推测Mobud7可能影响稻瘟病菌附着胞内糖类物质降解过程,从而影响附着胞内膨压的形成和后续的侵染过程。第三,通过亚细胞定位实验进一步解析Mobud7的分子功能,结果表明:Mobud7定位于细胞质中,且在附着胞阶段荧光强度最大,这与Mobud7在稻瘟菌不同侵染阶段中的表达量水平相一致。最后,已知出芽酵母（S.cerevisiae）中Bud7为ChAPs蛋白家族的主要组分之一,该蛋白家族还包括Bch1、Bch2和Chs6,且在小GTP酶Arf1提供的能量作用下,该复合物通过与Chs5互作将几丁质合成酶Chs3由高尔基体上运输至细胞膜上;通过蛋白序列比对后发现酵母Bch1、Chs6和Bud7在稻瘟菌中的同源物均为Mobud7,Chs5和Arf1在稻瘟菌中的同源即为MGG02799和MoArf1基因。利用pu11-down和酵母双杂交实验均发现:Mobud7与其自身、MoArf1和MGG02799间均存在互作;酵母双杂交实验进一步证明Mobud7与其自身、MoArf1和MGG02799间的物理互作。基于以上结果,初步推断Mobud7在稻瘟菌中可能参与糖类物质降解相关蛋白的运输,从而影响附着胞的形成和成熟,并最终影响致病力。