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背景糖尿病肾病(Diabetic Nephropathy,DN)作为糖尿病(Diabetes Mellitus,DM)的主要并发症,现已成为导致终末期肾脏病发生最主要的原因。但糖尿病肾病发病机制复杂且尚不明确,临床上尚无针对糖尿病肾病有效的治疗方法。有研究表明拮抗血管内皮生长因子B(Vascular endothelial growth factor B,VEGF-B)后可以通过减轻肾脏脂毒性来改善糖尿病肾病,但是尚无证据表明单独拮抗血管内皮生长因子B可以减轻糖尿病肾病其他致病因素的作用,例如氧化应激与炎症反应。此外,有研究显示白介素22(Interleukin-22,IL-22)可通过减轻肾脏炎症反应来改善糖尿病肾病。目的本研究旨在构建具有抗-VEGFB抗体以及IL-22生物学效应的融合蛋白,并进一步研究该融合蛋白对糖尿病肾病的治疗作用及相关机制。方法1.通过ELLSA试剂盒检测非糖尿病非糖尿病肾病受试者以及糖尿病肾病患者血清中VEGF-B及IL-22含量;通过免疫组化检测糖尿病肾病患者肾脏组织中VEGF-B的表达含量;利用免疫荧光检测糖尿病肾病患者肾脏组织中炎症相关蛋白NLRP3及脂肪分化蛋白ADFP的表达水平。2.将抗-VEGFB抗体与IL-22基因序列相连并插入表达载体,最后表达纯化获得anti-VEGFB/IL22融合蛋白;通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)与排阻色谱法检测anti-VEGFB/IL22融合蛋白的分子量大小及纯度;通过表面等离子共振技术检测融合蛋白亲和力;利用蛋白印迹以及激光共聚焦验证anti-VEGFB/IL22融合蛋白同时具有抗-VEGFB单克隆抗体以及IL-22的生物活性。3.通过高糖高脂饮食喂养db/db小鼠构建糖尿病肾病动物模型:使用生化试剂盒及ELLSA试剂盒检测小鼠血糖、血甘油三酯、血胆固醇、血肌酐、血尿素氮、尿微量白蛋白、尿肌酐、尿蛋白;对小鼠肾脏组织切片进行HE染色、Masson染色评估病理损伤及肾脏纤维化程度;利用电镜观察小鼠肾脏肾小球足突病变情况及测量基底膜厚度;将小鼠肾脏组织匀浆后通过蛋白印迹分析小鼠肾脏纤维化相关蛋白:CollagenⅣ、Vimentin、α-SMA的表达水平。4.使用Mito SOX试剂盒及JC-1试剂盒检测小鼠肾脏中线粒体活性氧水平及线粒体功能;通过蛋白印迹测定小鼠肾脏炎症相关蛋白:NLRP3、Cleaved Caspase-1、MatureIL-1β表达水平;通过免疫组化检测小鼠肾脏炎症相关指标TGF-β、NF-κB表达情况;对小鼠肾脏切片进行油红O染色评估肾脏脂质聚集程度;通过免疫荧光检测小鼠肾脏组织中FATP4及ADFP的表达水平,进一步评估小鼠肾脏脂质转运及沉积水平;使用蛋白印迹检测小鼠肝脏及肾脏组织中胰岛素信号通路相关蛋白:p-IRS-1、IRS-1、p-ERK1/2、ERK1/2、p-AKT、AKT水平;对小鼠肾脏进行糖原染色(PAS染色)评估肾脏糖原沉积水平。结果1.在对糖尿病肾病患者血清进行检测后发现:相比于非糖尿病非糖尿病肾病受试者,糖尿病肾病患者血清中VEGF-B水平升高,而IL-22水平下降;进行相关性分析发现糖尿病肾病患者血清VEGF-B水平与ACR水平呈正相关,而血清IL-22水平与ACR呈负相关;此外,糖尿病肾病患者肾脏中VEGF-B水平显著高于非糖尿病非糖尿病肾病受试者;且糖尿病肾病患者肾脏中脂肪酸分化蛋白ADFP水平及炎症相关蛋白NLRP3水平均显著升高。2.聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)与排阻色谱法检测anti-VEGFB/IL22融合蛋白与抗-VEGFB单克隆抗体的分子量及纯度;表面等离子共振技术发现anti-VEGFB/IL22融合蛋白、抗-VEGFB单克隆抗体与VEGF-B抗原具有较高亲和力;此外,anti-VEGFB/IL22融合蛋白不仅可以激活IL-22信号通路蛋白p-STAT3、p-AKT表达,也可以减轻高糖诱导的氧化应激和线粒体功能障碍,这些结果表明融合蛋白具有IL-22的生物学活性;此外anti-VEGFB/IL22融合蛋白可以阻断VEGF-B诱导的FATP4的高表达,表明anti-VEGFB/IL22融合蛋白具有抗-VEGFB单克隆抗体的生物学活性。3.高脂饮食喂养后的db/db小鼠表现出ACR、血肌酐、血尿素氮、血糖、血甘油三酯、血胆固醇水平的升高,成功构建糖尿病肾病小鼠;给予anti-VEGFB/IL22融合蛋白治疗8周后,糖尿病肾病小鼠ACR、血肌酐、血尿素氮、血糖、血甘油三酯、血胆固醇水平显著降低;anti-VEGFB/IL22融合蛋白减轻糖尿病肾病小鼠肾脏组织病理损伤,改善糖尿病肾病小鼠足突脱落、足突融合、基底膜增厚。4.anti-VEGFB/IL22融合蛋白降低糖尿病肾病小鼠肾脏组织炎症反应相关蛋白:NLRP3、Cleaved Caspase-1、Mature IL-1β表达水平,减轻炎症因子(TNF-α、NF-κB)表达,减轻氧化应激水平及线粒体功能障碍;此外,油红O染色及免疫荧光染色分析发现anti-VEGFB/IL22融合蛋白可以减轻糖尿病肾病小鼠肾脏组织中中性脂聚集程度,降低ADFP及FATP4表达水平;anti-VEGFB/IL22也可以减轻糖尿病肾病小鼠肾脏组织中的糖原聚集,增加糖尿病肾病小鼠肝脏及肾脏组织中胰岛素信号通路相关蛋白p-IRS-1、p-ERK/2、p-AKT表达水平。结论我们发现糖尿病肾病患者血清中VEGF-B水平明显上调,而IL-22水平下调,可能与糖尿病肾病的进展有关。基于以上认识,我们成功构建并纯化一种新的anti-VEGF-B/IL-22融合蛋白,同时具有抗VEGF-B抗体和IL-22的生物活性。我们进一步证实anti-VEGFB/IL22融合蛋白可以改善肾小球和肾小管脂质蓄积,同时减轻氧化应激和炎症反应,进一步改善糖尿病肾病。此外,anti-VEGFB/IL22融合蛋白还可增加胰岛素敏感性。总之,这些发现表明anti-VEGFB/IL22融合蛋白有望成为糖尿病肾病的一种前瞻性治疗药物。