漠河冻土区是我国仅有的高纬度多年冻土区,处于中国的最北端。随着全球变暖,多年冻土区不断萎缩,对漠河冻土环境的抢救性研究也迫在眉睫。漠河冻土区还具有巨大的天然气水合物成藏潜力,对其中环境微生物的研究可对微生物勘探技术提供支持。另外由于其独特的自然环境,漠河冻土区可能蕴藏着丰富而独特的微生物资源。本研究主要着眼于漠河多年冻土区地下20-1700米环境中微生物群落的结构和多样性,结合分离培养法、454高通量测序技术、荧光实时定量PCR技术等,得到以下结果：1.从漠河冻土区地下岩石样品中共分离出322株可培养微生物,经16S rRNA鉴定属于121个种、61个属、5个门,分别是放线菌门、变形球菌-栖热菌门、厚壁菌门、变形菌门和拟杆菌门,其中的优势菌属为芽孢杆菌属、不动杆菌属、短波单胞菌属等。经鉴定共得到117株低温菌,通过分解圈法对产5种低温酶的菌株进行初步筛选,结果有40株产淀粉酶,76株产纤维素酶,53株产蛋白酶,70株产脂肪酶,51株产β-半乳糖苷酶。从中选出8株酶活较高的菌株,检测其所产淀粉酶和纤维素酶在不同温度下的酶学特性,其中的两株低温菌所产淀粉酶在4℃时分别保持其最高酶活的53%和45%,纤维素酶分别保持最高酶活的40%和70%,表现出了极具价值的应用潜力。2.基于16SrRNA基因,利用454测序技术分析了漠河冻土区地下环境中总细菌和古菌的群落结构和多样性。细菌方面共得到20948条Reads、1190个OTU、358个Phylotype,包含的细菌类群有酸杆菌门、放线菌门、拟杆菌门、绿菌门、异常球菌-栖热菌门、纤维杆菌门、梭杆菌门、芽单胞菌门、变形菌门、疣微菌门、厚壁菌门和未分类细菌,其中变形菌门和放线菌门为优势菌群,其次为厚壁菌门、拟杆菌门和异常球菌-栖热菌门。古菌方面共得到90948条Reads,737个OTU、12个Phylotype,古菌类群只有广古菌门、泉古菌门和未分类古菌,且在不同地层差异很大。基于OTU的分析表明,漠河冻土区地下环境中细菌的丰富度(Chao1估计)为150-230种,香农指数为4.3-4.7,辛普森指数为35-66,与其他环境相比多样性处于中下水平,并且不同样品间细菌的群落结构差别较大。古菌的丰富度(Chao1估计)为60-440种,香农指数为0.0-1.3,辛普森指数为1.0-2.3,古菌在不同地层分布不均匀,多样性较低,各样品的OTU组成差异很大,部分样品之间的OTU结构十分相似。基于Phylotype的分析表明,Thermopolyspora属和Sphingobium属的细菌在漠河冻土区地下环境中占优势地位(平均相对丰度>5%)。就类别而言,嗜热细菌在其中占据相当大的比例(14-26%),其最适生长温度多在45-55℃。在部分地层检测到了产甲烷古菌,在另外一些地层则检测到了嗜热古菌。结合其中大量的嗜热细菌和甲烷成因,我们推测历史上有一段是古菌产甲烷时期,后来部分地层又经历了一个地热时期,嗜热古菌和细菌幸存下来并成为漠河地下的优势菌群,这一时期同时也产生了热解甲烷气。3.应用实时荧光定量PCR对样品中各菌群微生物基因进行了定量,结果表明漠河地下环境中总细菌基因拷贝数为106-107copies·gdw-1,放线菌为104copies· gdw-1, a-变形菌为103-104copies-gdw-1,β-变形菌为105-106copies·gdw-1,拟杆菌门为104-107copies·gdw-1,厚壁菌门为105-106copies·gdw1,真菌为103copies·gdw1。拟杆菌门、p-变形菌和厚壁菌门细菌在其中较为丰富。4.通过多相分类研究确立了菌株M0116T的新种地位。M0116T为革兰氏阴性、黄色、严格好氧细菌,分离于中国东北漠河盆地的沉积物中。色素类型为黄色素。细胞为过氧化氢酶和氧化酶阳性、不滑动杆菌。基于16S rRNA基因的系统发育分析表明漠河杆菌属于黄杆菌科的一员,与Empedobacter, Wautersiella口Weeksella属最为相近,相似度为90.5-91.0%。主要的脂肪酸为iso-C15:0和iso-C17:03-OH,主要呼吸醌为MK-6,主要极性脂为磷脂酰乙醇胺(PE),主要的多胺为高精脒,GC含量为38.2%。基于表型和基因型数据,M0116T被认为是黄杆菌科的新属和新种,将其命名为Moheibacter sediminis。模式株为M0116T(=CGMCC1.12708T=JCM19634T)。同时根据新的实验数据对Empedobacter brevis, Wautersiella falsenii和Weeksella virosa的描述进行了修订。