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研究目的： 1、研究VEGFR2抑制剂阿帕替尼对人甲状腺乳头状癌细胞生长的影响。 2、通过体外实验和BALB／c免疫缺陷小鼠甲状腺乳头状癌移植瘤模型体内实验研究阿帕替尼对甲状腺乳头状癌的治疗作用及其机制。 3、探索自噬在阿帕替尼处理甲状腺癌细胞中的作用以及机制，以及自噬抑制剂与阿帕替尼联合应用对甲状腺乳头状细胞癌生长的影响及其机制。 研究方法： 1、应用免疫组织化学染色方法检测甲状腺乳头状癌患者组织中VEGFR2的表达水平及与临床相关性。采用q-PCR及Western-blot方法检测甲状腺乳头状癌患者肿瘤组织及正常组织中VEGFR2mRNA及蛋白表达水平，以及不同甲状腺细胞系中VEGFR mRNA及蛋白表达水平。 2、通过CCK-8法检测不同浓度及不同作用时间阿帕替尼对甲状腺乳头状癌细胞系K-I及KTC-I增殖的影响。利用划痕实验及Transwell实验检测阿帕替尼对肿瘤细胞迁移和侵袭能力的影响。应用AnnexinⅤ/PI双染法检测阿帕替尼对甲状腺乳头状癌细胞凋亡的影响，应用PI染色法检测阿帕替尼对细胞周期的影响；并采用Western-blot法检测阿帕替尼处理后K-1及KTC-1细胞中PI3K/Akt信号通路蛋白及周期与凋亡相关蛋白水平的变化。 3、通过建立BALB/c免疫缺陷小鼠甲状腺乳头状癌移植瘤模型，检测阿帕替尼对甲状腺乳头状癌的体内作用。 4、采用免疫荧光法检测经阿帕替尼处理后甲状腺癌细胞自噬标志蛋白LC3B的表达情况，通过透射电镜观察阿帕替尼处理后甲状腺乳头状癌细胞系K-1及KTC-1细胞胞浆中自噬小体形成情况；阿帕替尼联合自噬抑制剂氯喹(HCQ)处理细胞后采用Western-blot方法检测自噬标志蛋白LC3B的表达水平。 5、应用自噬抑制剂3-MA联合阿帕替尼处理细胞后，通过免疫荧光法检测胞浆中LC3B的表达情况，应用透射电镜观察自噬小体形成情况，明确甲状腺乳头状癌细胞自噬水平，并采用AnnexinⅤ/PI双染法检测阿帕替尼与3-MA联合应用对甲状腺乳头状癌细胞凋亡的影响；过Western-blot法检测自噬相关蛋白及凋亡蛋白的表达水平。 6、通过转染小干扰RNA ATG5下调自噬相关基因ATG5的表达，再次应用DMSO及阿帕替尼处理两组细胞，并应用Western-blot法检测自噬相关蛋白及凋亡蛋白的表达水平。 研究结果： 1、甲状腺乳头状癌患者肿瘤组织中的VEGFR2的表达水平明显高于癌旁正常组织，且VEGFR2的表达水平与肿瘤大小、癌灶个数及淋巴结转移相关。甲状腺乳头状癌细胞系K-1及KTC-1VEGFR2的mRNA及蛋白表达水平明显高于正常甲状腺滤泡上皮细胞Nthy Ori3-1。 2、以甲状腺乳头状癌细胞系K-1及KTC-1为研究对象，CCK-8结果显示阿帕替尼对于K-1及KTC-1均有抑制增殖的作用，且呈浓度及时间依赖性。划痕实验及Transwell实验结果显示阿帕替尼可以抑制K-1及KTC-1的迁徙和侵袭。克隆形成实验结果显示阿帕替尼可以抑制K-1及KTC-1的克隆形成能力，并呈浓度依赖性。通过AnnexinⅤ/PI双染法检测实验表明阿帕替尼可诱导细胞出现凋亡及G0/G1期周期阻滞，并呈浓度依赖性。Western-blot显示在蛋白水平，阿帕替尼可导致Akt磷酸化水平下降，同时凋亡蛋白cleaved-PARP、Bax表达上调，凋亡抑制蛋白Bcl-2表达下调，以及周期蛋白CyclinD1下调及P21上调。 3、以BALB/c免疫缺陷小鼠为研究对象，应用甲状腺乳头状癌细胞系K-1建立移植瘤模型，待皮下肿瘤生长至3*3*3mm3，阿帕替尼100mg/kg/天连续灌胃4周，停药后观察2周，结果显示与对照组相比，阿帕替尼组小鼠移植瘤明显缩小。免疫组织化学染色显示阿帕替尼组小鼠组织中VEGFR2、Ki-67表达下调。 4、以甲状腺乳头状癌细胞系K-1及KTC-1为研究对象，免疫荧光染色显示阿帕替尼处理后细胞胞浆中自噬标志蛋白LC3B的表达量明显增加，透射电镜下观察细胞胞浆中自噬小体明显增加。Western-blot结果显示，阿帕替尼联合自噬抑制剂HCQ处理组细胞LC3B表达下降，自噬底物P62表达上调，凋亡蛋白cleaved-PARP表达上调。 5、以甲状腺乳头状癌细胞系K-1为研究对象，应用阿帕替尼处理细胞后，应用自噬抑制剂3-MA抑制自噬，应用AnnexinⅤ/PI双染法检测细胞凋亡，结果显示3-MA明显增强了阿帕替尼诱导K-1凋亡的能力，而单独用药并不能导致K-1的凋亡。Western-blot蛋白检测结果显示，应用3-MA降低了LC3B的表达，阿帕替尼与3-MA联合应用组上调了cleaved-PARP的表达，下调了Bcl-2的表达。 6、通过转染小干扰RNA ATG5特异性干扰ATG5的表达抑制自噬，再联合应用阿帕替尼处理细胞，通过Western-blot蛋白检测结果显示，ATG5表达受抑制组细胞，应用阿帕替尼处理，凋亡蛋白cleaved-PARP的表达明显上调。 研究结论： 1、甲状腺乳头状癌组织中VEGFR2表达水平比正常甲状腺组织高，且于肿瘤大小、多灶性及淋巴结转移密切相关。 2、体内及体外实验证实阿帕替尼可以抑制甲状腺乳头状癌生长，促进凋亡。 3、阿帕替尼可以诱导甲状腺癌细胞出现细胞保护性自噬，自噬抑制剂与阿帕替尼联合应用可进一步抑制甲状腺乳头状癌细胞增殖，诱导PARP/Bcl-2介导的细胞凋亡。